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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203927

Resumo

OLIVEIRA, J.T. Caracterização e avaliação da capacidade imunogênica da enolase de Conidiobolus lamprauges. 2016. 32f. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias), Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, Brasil. Enolase, uma importante enzima glicolítica, com expressão aumentada a 37°C em Conidiobolus (C.) lamprauges, exerce diferentes funções em outros micro-organismos, dentre elas, a adesão e invasão em hospedeiros. Desta forma, a identificação da enolase como proteína imunorreativa pode contribuir para a compreensão da doença, auxiliar na padronização de testes sorológicos e também o desenvolvimento de vacinas, consequentemente, tratamentos mais eficientes e redução na morte dos animais. Os objetivos deste trabalho foram caracterizar o gene enolase (eno) de C. lamprauges e avaliar sua capacidade imunogênica frente a soros de ovinos naturalmente infectados. A amplificação de eno do isolado de C. lamprauges, através dos oligonucleotídeos sintetizados com base na sequência do gene de C. lamprauges, resultou em fragmento de 1305pb. A sequência deduzida de aminoácidos foi de 434 resíduos sendo a massa molecular estimada de 47,2KDa. Na análise da sequência, identificou-se a assinatura do gene enolase (LLLKVNQIGTVSES) correspondentes às posições 342 a 345. Na análise in silico foram detectadas regiões prováveis para epítopos para linfócitos T e B. A sequência foi clonada no plasmídeo pFN6K (HQ) Flexi® Vector (Promega®) e a proteína expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS com indução por IPTG. No SDS-PAGE e no Western blot, a eno recombinante foi detectada com peso molecular estimado em 47kDa. Detectou-se IgG recombinante anti enolase em todos os animais com conidiobolomicose, através da técnica de Western blot, demonstrando a imunogenicidade. No soro de ovino saudável, utilizado como controle negativo, e no soro de ovino com pitiose, utilizado para avaliar reatividade cruzada, não foram detectadas bandas, demonstrando que a enolase recombinante de C. lamprauges, é imunogênica contra soros de ovinos naturalmente infectados com conidiobolomicose. A detecção de anticorpos anti-enolase específicos nos animais evidenciam que a proteína é um antígeno candidato bastante promissor para o desenvolvimento de vacinas.

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OLIVEIRA, J.T. Characterization and evaluation of immunogenicity of Conidiobolus lamprauges enolase. 2016. 32f. Thesis (Doctorate in Veterinary Science), Veterinary Science Postgraduate, Faculty of Veterinary, Federal University of Mato Grosso, Cuiabá, Brazil. Enolase, an important glycolytic enzyme with increased expression at 37°C in Conidiobolus (C.) lamprauges, performs different functions in other organisms, among them, adhesion and invasion of hosts. Thus, the identification of enolase as an immunoreactive protein may contribute to the understanding of these diseases; provide the standardization of serological tests and also develop vaccines, thus bringing more effective treatments and reducing the death of animals. The objectives of this study were to characterize the enolase gene (eno) C. lamprauges and evaluate its immunogenic capacity towards naturally infected sheep. Eno gene amplification isolated from C. lamprauges by the oligonucleotides synthesized based on the sequence of the gene C. lamprauges resulted in a 1305pb fragment. The deduced aminoacid sequence comprised 434 residues with a predicted molecular weight of 47,2KDa. In the sequence analysis, we identified the signing of the enolase gene (LLLKVNQIGTVSES) corresponding to positions 342-345. In the analysis "in silico" probable regions were detected for epitopes to T and B lymphocytes. The sequence was cloned into the plasmid pFN6K (HQ) Flexi® Vector (Promega®) and the protein expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS cells with IPTG induction. In SDS-PAGE and Western blot, the recombinant eno was detected with estimated molecular weight of 47kDa. Recombinant IgG anti-enolase was found is in all animals with conidiobolomycosis by means of the Western blot technique, demonstrating immunogenicity. In healthy sheep serum, used as a negative control, and serum from sheep with pythiosis used to evaluate cross-reactivity, bands were not detected. Therefore, this study demonstrated that recombinant enolase C. lamprauges is immunogenic against serum of naturally infected sheep with conidiobolomycosis. The detection of specific anti-enolase antibodies in animals shows that the protein is a promising candidate antigen for the development of effective vaccine against this disease.

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