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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-205333

Resumo

O hormônio liberador de gonadotropina (GnRH) é um dos fatores chaves na regulação neuroendócrina da reprodução dos vertebrados. Alguns peixes apresentam três variantes do GnRH: o GnRH1 envolvido na secreção de gonadotropinas, o GnRH2 que regula o comportamento alimentar e sexual e o GnRH3 expresso no bulbo olfatório e o nervo terminal cujas fibras nervosas inervam a retina e o epitélio olfatório. O zebrafish possui duas variantes do GnRH (GnRH2 e GnRH3), sendo o GnRH3 a variante hipofisiotrófica. Estudos mostram possível envolvimento do GnRH no sistema olfato-retinal. No sistema olfatório o GnRH regula a sensibilidade na detecção de alimento, o reconhecimento intra e interespecífico, entre outros. Na retina, o GnRH3 pode estar envolvido na acuidade visual e do processamento de informação da retina. Existem estudos que reportam a presença de receptores de GnRH em diferentes camadas da retina, no entanto ainda não é clara a presença de receptores no epitélio olfatório. Neste contexto, no presente estudo analisamos a localização do gnrh2, gnrh3 e seus receptores (gnrhr1,2,3 e 4) e do gnih (hormônio inibidor de gonadotropinas) no epitélio olfatório, a retina e o bulbo olfatório de machos e fêmeas adultos e comparamos a expressão destes genes em fêmeas em diferentes estágios de maturação gonadal. Para tanto, o RNA total do epitélio olfatório, retina, bulbo olfatório, cérebro e gônadas foi extraído. Com base na sequência dos genes gnrh2, gnrh3, gnrhr1, gnrhr2, gnrhr3 e gnrhr4, primers forward e reverse foram desenhados para RT-PCR e qPCR. Sondas para a hibridização in situ também foram construídas para verificar os sítios de expressão destas moléculas no epitélio olfatório, retina e gônadas. Imunohistoquímica com os anticorpos anti-GnRH3 (BB8 e GF6) foram realizadas para localizar a proteína do GnRH3 nos tecidos analisados. O presente estudo apresenta um panorama da expressão do sistema GnRH/GnIH e seus receptores no eixo epitélio olfatório-bulbo e olfatório-retina ao longo dos estágios de maturação gonadal em fêmeas de zebrafish. Os resultados mostram que no epitélio olfatório há um aumento na expressão dos receptores de GnRH nos estágios finais de maturação ovariana. O epitélio olfatório apresenta GnRH3 no citoplasma dos neurônios do receptor olfatório, assim como nos cílios destas células e também nas fibras do nervo olfatório. No bulbo olfatório, interessantemente, encontramos uma relação inversa entre a expressão de gnih e gnrh3 em todos os estágios de maturação gonadal. Na retina, os sítios de expressão do receptor gnrhr4 ocorrem nos núcleos das células amácrinas, bipolares e ganglionares, onde também foram observadas fibras positivas ao GnRH3. Nas gônadas femininas, o GnRH3 e seus receptores (gnrhr2 e gnrhr4) ocorrem em oócitos perinucleolares, enquanto que o gnih em oócitos em estágio de alvéolo cortical. Nas gônadas masculinas, o GnRH3 e seus receptores (gnrhr1 e gnrhr4) ocorrem em células germinativas (principalmente na gerações espermatogoniais), células de Sertoli e células de Leydig, enquanto que o gnih é amplamente expresso nas células germinativas e células intersticiais. O presente trabalho, de forma inédita, apresenta as variações na expressão gênica do sistema gnrh2, gnrh3, gnih, e das diferentes isoformas do receptor de GnRH (gnrhr1, gnrhr2, gnrhr3 e gnrhr4) nos três componentes do sistema olfato-retinal assim como nos ovários, sugerindo que o sistema GnRH/GnIH possa estar envolvido na neuromodulação dos sistemas sensoriais (olfatório e visual) especialmente nos estágios finais da maturação assim como a possível regulação dos processos de esteroidogênese e gametogênese nas gônadas do zebrafish.

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The gonadotropin releasing hormone (GnRH) is one of the key factors involved in the neuroendocrine regulation of vertebrate reproduction. Some fish species have three GnRH variants: GnRH1 involved in gonadotropin secretion, GnRH2 regulating food and sexual behaviors and the GnRH3 which is expressed in the olfactory bulb and terminal nerve whose fibers innervate the retina and the olfactory epithelium. Two GnRH variants (GnRH2 and GnRH3) are present in the zebrafish, in which GnRH3 acts as the hypophisiotrophic variant. Recent studies have been showing the role of GnRH in the olfactory-retinal system. In the olfactory system, GnRH regulates food detection, and intra and interspecific recognition. In retina, GnRH3 may be involved in visual acuity modulation and retinal processing information. Moreover, studies have reported the presence of GnRH receptors in the retina, but not yet in the zebrafish olfactory epithelium. Therefore, the current study analyzed the presence of GnRH2, GnRH3 and its receptors (GnRH-R1,2,3 and 4) and GnIH (gonadotropin inhibitory hormone) in the olfactory epithelium, olfactory bulb, retina and in gonads of adult zebrafish. We also compared the expression of these genes during the different stages of ovarian maturation in zebrafish. For that, total RNA of the olfactory epithelium, olfactory bulb, retina and gonads was extracted with the PureLink® RNA Mini Kit(Ambion®). RT-PCR and qPCR analysis were performed using forward and reverse primers for gnrh2, gnrh3, gnrhr1, gnrhr2, gnrhr3, gnrhr4 for . Probes for in situ hybridization were constructed to verify the expression sites of these molecules in the olfactory epithelium, retina, and gonads. Immunohistochemistry usingantiGnRH3 antibodies (BB8 and GF6) were performed to identify the GnRH3 protein in these tissues. The current study presents a general expression view of GnRH/GnIH and their receptors in the olfactory epithelium-olfactory bulb-retinal axis during the female gonadal maturation in zebrafish. Our results showed an increase of GnRH receptor transcripts in the olfactory epithelium at the final stages of ovarian maturation. The olfactory epithelium exhibited GnRH3 in the cytoplasm of the olfactory receptor neurons, as well as the cilia of these cells and also in the olfactory nerve fibers. Interestingly, we found an inverse expression pattern for gnih and gnrh3 in the olfactory bulb, in all maturation stages. In the retina, gnrhr4 expression was found in the nuclei of amacrine, bipolar, and ganglion cells, where GnRH3 positive fibers could also be observed nearby to gnrhr4 expressing cells. In the female gonads, GnRH3 and their receptors (gnrhr2 and gnrhr4) were found in perinucleolar oocytes, whereas gnih in the cortical alveolus oocytes. In testis, GnRH3 and their receptors (gnrhr1 and gnrhr4) occur in germ cells (mainly in spermatogonial generations), Sertoli cells and Leydig cells, whereas gnih is widely expressed in germ cells and interstitial cells. This work describes for the first time the changes of gnrh2, gnrh3, gnih and the different GnRH receptor isoforms (gnrhr1, gnrhr2, gnrhr3, gnrhr4) expression in the three components of olfactory-retinal system, and in the ovary as well. Our results suggest that GnRH / GnIH system is involved in the neuromodulation of the sensorial system particularly at the final stages of maturation. We also address a possible role of GnRH/GnIH in steroidogenesis and gametogenesis processes in zebrafish gonads.

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