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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-206023

Resumo

A técnica de criopreservação espermática é simples e possibilita a criação de 11 bancos de germoplasma, permitindo a conservação da diversidade genética e 12 reposição de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, durante o processo de 13 criopreservação as células congeladas podem ser danificadas pela toxicidade de 14 crioprotetores, pelos cristais de gelo, resultando em danos ao DNA, mitocôndria, 15 membrana e interferindo na cinética dos espermatozoides. O objetivo do trabalho é 16 avaliar o efeito crioprotetordos açucares não penetrantes: Trealose, Rafinose, 17 Sacarose e Lactose nas concentrações de 50 mM, 100 mM e 150 mM, sobre as 18 células espermáticas de Piaractus mesopotamicus. Foi coletado esperma de 14 19 animais, através de massagem abdominal, sendo induzidos hormonalmente com 20 extrato de hipófise de carpa 12h antes àextrusão. Em seguida, as amostras coletadas 21 foram diluídas em Beltsville Thawing Solution (BTS), contendo o crioprotetor 22 penetrante dimetilsulfóxido (DSMO) a concentração de 10% (controle) e nos demais 23 tratamentos foram adicionados as diferentes concentrações dos açúcares. Após 60 24 dias, foram feitas análises de movimentação celular (motilidade total e progressiva, 25 período de motilidade, DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL, STR, LIN, WOB, ALH e BCF) 26 pelo Computer Assisted Semen Analysis (CASA) e análise das estruturas celulares: 27 integridade de DNA, de membrana, funcionalidade mitocondrial, fluidez de membrana 28 e espécies reativas de oxigênio (ROS), através de citometria de fluxo. Foi realizado o 29 teste de normalidade de Shapiro Wilk, com posterior analise de variância através do 30 teste de Kruskal Wallis, devido os dados não se comportarem de forma paramétrica. 31 Com relação aos parâmetros cinéticos da célula, houve correlações significativas (P 32 < 0,05) entre as variáveis de período de motilidade, motilidade total e motilidade 33 progressiva dos espermatozoides, utilizando os tratamentos contendo concentração 34 de 50 mM de rafinose, 100 mM de sacarose e 100 mM de lactose suplementados com 35 BTS 10%, sendo superiores (P < 0,05) aos resultados obtidos nas demais 36 concentrações dos açucares e ao tratamento controle (Tabela 2). A maior motilidade 37 (cerca de 36,5%) observada foi com rafinose na concentração de 100 mM. Os 38 tratamentos contendo rafinose (50 mM), sacarose (100 mM) e lactose (100 mM) 39 suplementados com 10% de BTS ao esperma de Pacu, não diferiram entre si nas 40 avaliações de fluidez de membrana, integridade mitocondrial, ROS e integridade de 41 DNA (P < 0,05). Considerando os parâmetros de Cinética (Motilidade Total e 42 Progresiva), Integridade Mitocondrial, Espécies Reativas de Oxigênio (ROS), Fluidez 43 de Membrana e Integridade de DNA, importantes para taxa de fertilidade, os 44 tratamentos que estiveram entre os melhores resultados para a utilização das açucares testados como crioprotetores para espermatozoides de Piaractus mesopotamicus foram Rafinse 50 mM, Sacarose 100 mM e Lactose 100 mM.

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The sperm cryopreservation technique is simple and allows the creation of 22 germplasm banks, allowing conservation of genetic diversity and replacement of 23 endangered species. However, during the cryopreservation process the frozen cells 24 can be damaged by cryoprotectant toxicity by ice crystals, resulting in damage to DNA, 25 mitochondria, membrane and interfering with sperm kinetics. The objective of this work 26 is to evaluate the cryoprotectant effect of non-penetrating sugars: Trehalose, Rafinose, 27 Saccharose and Lactose in concentrations of 50 mM, 100 mM and 150 mM, on the 28 sperm cells of Piaractus mesopotamicus. Sperm were collected from 14 animals, 29 through abdominal massage, being hormonally induced with carp pituitary extract 12h 30 before extrusion. Then the samples were diluted in Beltsville Thawing Solution (BTS) 31 containing the penetrant cryoprotectant dimethylsulfoxide (DSMO) at a concentration 32 of 10% (control) and in the other treatments were added the different concentrations 33 of sugars. After 60 days, cell movement analysis (total and progressive motility, DAP, 34 DCL, DSL, VAP, VCL, VSL, STR, LIN, WOB, ALH and BCF) were performed by 35 Computer Assisted Semen Analysis (CASA) And analysis of cell structures: DNA 36 integrity, membrane integrity, mitochondrial functionality, membrane fluidity and 37 reactive oxygen species (ROS), through flow cytometry. The normality test of Shapiro 38 - Wilk was performed, with a posterior analysis of variance using the Kruskal Wallis 39 test, because the data did not behave parametrically. Regarding the kinetic parameters 40 of the cell, there were significant correlations (P <0.05) between the motile period, total 41 motility and progressive motile spermatozoa, using treatments containing 50 mM 42 raffinose, 100 mM sucrose and 100 mM lactose supplemented with 10% BTS, being 43 superior (P <0.05) to the results obtained in the other sugar concentrations and to the 44 control treatment (Table 2). The highest motility (about 36.5%) observed was with 45 raffinose at the concentration of 100 mM. Treatments containing raffinose (50 mM),sucrose (100 mM) and lactose (100 mM) supplemented with 10% BTS to Pacu sperm 1 did not differ in the assessments of membrane fluidity, mitochondrial integrity, ROS 2 and DNA integrity (P <0.05). Considering the parameters of Kinetics (Total and 3 Progressive Motility), Mitochondrial Integrity, Reactive Oxygen Species (ROS), 4 Membrane Fluidity and DNA Integrity, important for fertility rate, treatments that were 5 among the best results for the use of sugars Tested as cryoprotectants for 6 spermatozoa of Piaractus mesopotamicus were 50 mM Rafinse, 100 mM Saccharose 7 and 100 mM Lactose.

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