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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-208249

Resumo

A ocorrência de infecções como a triquinelose impõe restrições ao comércio internacional de carnes suínas. A triquinelose é uma zoonose distribuída globalmente causada por nematódeos parasitas do gênero Trichinella spp. A infecção é adquirida quando humanos ou animais consomem carne crua e/ou malcozida infectada com larvas do parasita. Nas últimas décadas, muitos surtos de triquinelose humana têm sido relatados em vários países inclusive a Argentina. O Brasil não possui relatos de triquinelose até o momento. Mesmo assim, países que importam nossa carne suína exigem testes que demonstrem que o produto esteja livre dos parasitos. O método de digestão muscular no qual se utilizam fragmentos de diafragma é recomendado para rotina de inspeção da carne visando a detecção de larvas de Trichinella spp. Esse método é de fácil aplicação, mas apresenta limitação na sensibilidade e não permite classificar isolados de Trichinella em nível de espécie. Neste estudo, o principal objetivo foi desenvolver um teste diagnóstico mais sensível e específico, baseado na reação em cadeia da polimerase (PCR), para complementar o método de referência utilizado até o momento. Para tanto, confeccionamos um gene sintético de Trichinella spp., que contempla regiões comuns aos diferentes genótipos conhecidos até o momento, como o segmento de expansão V (ESV) e o espaçador interno transcrito 1 e 2 (ITS-1, IST-2), e selecionamos 5 pares de primers (I a V) para a PCR visando a amplificação de todos os genótipos. O par de primers I tem como alvo o ESV presente em todos os genótipos de Trichinella spp. Os pares de primers II e III têm como alvo ITS-1 e são específicos para os genótipos 3 e 6; os pares de primers IV e V tem como alvo o ITS 2 e são específicos para os genótipos 5 e 7, respectivamente. Na amplificação, os primers amplificam fragmentos de DNA de diferentes tamanhos, em pares de bases (pb), o que possibilita a diferenciação do genótipo por meio de PCR multiplex. A sensibilidade de cada par de primer foi avaliada com diferentes concentrações de DNA, iniciando com 1000 pg (1ng) do plasmídeo pTrichS contendo ogene artificial e, a partir dessa concentração inicial, foram feitas diluições seriadas (1:10) até a concentração de 0,0001 pg de DNA. Além disso, neste estudo, coletamos um total de 175 amostras clínicas de tecidos de suídeos (suínos e javalis) para avaliação do método de diagnóstico por PCR. Utilizando-se o par de primers I foi possível detectar 0,1pg de DNA e com os pares de primers II, III, IV e V foi possível detectar 0,001pg de DNA, que corresponde a 0,01 larva. As amostras clínicas apresentaram resultados negativos após serem submetidas ao PCR multiplex. A PCR multiplex visando a amplificação do fragmento pTrichS resultou em um tamanho de pb esperados para cada espécie. Com este estudo nós demonstramos que a PCR pode servir de teste diagnóstico complementar à digestão muscular para amostras clínicas, pois permite detectar DNA correspondente à pelo menos uma larva de Trichinella spp. Além disso, a PCR pode ser usada sempre que houver a presença de larvas similares à Trichinella spp. no produto obtido após a digestão enzimática no qual for necessário um diagnóstico diferencial ou definitivo. E, finalmente, nos capacita para fazer frentes às novas e possíveis exigências sanitárias no comércio internacional de carnes de suínos.

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Parasitic diseases such as trichinellosis restrict the international trade of swine-derived products. Trichinellosis is a globally distributed zoonosis caused by nematodes of the genus Trichinella. The disease is transmitted when humans or animals feed on raw or undercooked meat harboring Trichinella larvae. In the last decades, several outbreaks of trichinellosis have been reported worldwide including in the neighboring country or Argentina, but not in Brazil which is considered free of trichinellosis. Nonetheless, for international trade, swine meat needs an official Trichinella-free diagnosis made by pepsin-HCl digestion of diaphragm tissue fragments. Although easily performed, the tissue digestion method lacks sensibility and does not allow identifying different species of Trichinella. In this study, our main goal was to develop a highly sensitive and specific molecular test based on the polymerase chain reaction (PCR) to unequivocally identify Trichinella in pig diaphragm tissue samples. Thus, we designed a synthetic Trichinella gene covering genomic regions common to different known Trichinella genotypes (genotypes T1 to T7), such as the expansion region V (ESV) and the internal transcribed spacer 1 (ITS-1) and ITS-2, and selected five pairs of PCR primers (I to V) aiming to detect all Trichinella genotypes. The primer pair I target the ESV region present in all Trichinella genotypes; primer pairs II and III target the IST-1 region and are specific to genotypes 3 and 6,and primer pairs IV and V target the IST-2 region and are specific to genotypes 5 and 7, respectively. Because the region targeted by each primer is different, the resulting PCR fragments have different size allowing genotype differentiation by multiplex PCR. The sensitivity of each pair of primer was evaluated with different concentration of the synthetic gene, starting with 1000 picograms (pg) of the plasmid pTrichS DNA in which the synthetic gene was cloned, and diluted down to 0.00001 pg of DNA. Furthermore, we collected 175 samples of Suidae (domestic pigs and wild boar) to be evaluated by PCR. With our PCR and primer pair I we were able to detect 0.1 pg of DNA and with pairs of primers II to V we could detect even 0.001 pg of DNA that corresponded to 0.01 larvae of Trichinella. The clinical samples were submitted to pepsin-HCL digestion and the DNA extracted was tested by multiplex PCR and resulted negative to Trichinella. With this study we demonstrated that the PCR should be a useful tool complementary to the pepsin-HCL digestion method to evaluate the presence of Trichinella in meat samples in that it allowed detecting DNA equivalent to 0.01 larvae. In addition, the PCR should be used to differentiate larvae similar to Trichinella in meat digested with pepsin-HCl to avoid a false-positive diagnosis. And, finally, with this PCR we are able to stand up facing the stringent marked requirements to diagnose pathogens in meat and offer a reliable and efficient method do diagnose Trichinella in swine meat.

Biblioteca responsável: BR68.1