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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-212956

Resumo

Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a eficiência da seleção espermática em amostras de ejaculados e epididimárias de cães domésticos, assim como verificar o efeito da adição de fluido prostático em amostras epididimárias, previamente ao resfriamento. Para tal, foram realizados três experimentos. No experimento 1, objetivou-se testar a eficiência da técnica de seleção espermática swimup modificado com adição de um coloide comercial (Androcoll-C) (SU-AC), quando realizada em diferentes formatos e grau de inclinação do tubo de migração, na tentativa de aumentar as taxas de recuperação e a qualidade espermática em sêmen canino fresco. Quinze amostras seminais obtidas de três cães foram submetidas aos tratamentos a seguir: T0-Controle: sêmen diluído em diluente comercial; T1: SU-AC em tubo Falcon, em posição vertical; T2: SU-AC em tubo de base arredondada, em posição vertical e T3: SU-AC em tubo de base arredondada, posicionado a 45°; após 3 minutos o T2 e T3 foram avaliados e outra alíquota de meio diluente foi reposta e avaliada 30 minutos depois, constituindo os tratamentos T2a e T3a, respectivamente. Não houve diferenças nas taxas de recuperação espermática, defeitos espermáticos totais, integridade de membrana plasmática e integridade de membrana acrossomal entre os tratamentos (P>0,05); houve uma diminuição dos parâmetros cinéticos, independente do formato do tubo de migração e sua inclinação em relação ao T0 (P<0,05); em posição vertical o formato do tubo não mostrou diferenças nas avaliações seminais (P>0,05); houve diminuição das patologias espermáticas quando usado o tubo de base arredondada inclinado, verificado na avaliação de 30 min após a renovação do meio. Conclui-se que não há melhora dos parâmetros cinéticos avaliados após a técnica de SU-AC; as taxas de recuperação espermática e a integridade celular, não são influenciadas pelo uso de tubos de migração de diferentes formatos e inclinação durante a realização da técnica de SU-AC; o SU-AC permite a obtenção de um número menor de patologias espermáticas, quando realizado em tubo de migração de base arredondada e inclinado com renovação do meio no tubo de migração, com recuperação e avaliação aos 30. No experimento 2, objetivou-se verificar o efeito da adição de 10 % de fluido prostático (FP) canino, em amostras espermáticas epididimárias (AEEs) prévio ao resfriamento por 24 horas entre 4 - 6 °C, obtidas por meio da técnica de fluxo retrógrado (FR) com uso de meio de manutenção comercial (MM) e soro fisiológico (SF). Foram obtidas AEEs a partir de oito pares de conjuntos testículo-epidídimo, pela técnica de FR com perfusão de MM ou SF com adição de ar. As AEEs foram padronizadas para 50 x 106 de espermatozoides / mL em MM (T1); as amostras coletadas com SF, foram subdivididas em três alíquotas, sendo uma ajustada para 50 x 106 de espermatozoides / mL em SF (T2); outra alíquota foi ajustada para 50 x 106 de espermatozoides / mL com MM acrescido de 10 % de SF (T3); a terceira alíquota foi ajustada para 50 x 106 de espermatozoides / mL com MM acrescido de 10 % de FP (T4). Durante 24 horas os tratamentos foram resfriados entre 4 6 °C e posteriormente avaliados quanto a motilidade espermática (MOT), vigor espermático (VIG), morfologia espermática, integridade funcional da membrana plasmática e teste de termorresistência (TTR). Não houve efeito (P>0,05) do MM ou do SF, na quantidade e qualidade dos espermatozoides recém coletados, porém, a preservação das amostras em presença de MM durante o resfriamento, influenciou favoravelmente na MOT, VIG e longevidade das amostras (P<0,05). A integridade funcional da membrana plasmática e as patologias espermáticas não mostraram diferenças (P>0,05) após resfriamento. Ao avaliar isoladamente a influência da adição 10 % de FP ao MM, não foram observadas diferenças nos parâmetros avaliados (P>0,05). Conclui-se que a técnica de fluxo retrógrado para recuperação de espermatozoides caninos pode ser realizada mediante perfusão de SF ou MM com adição de ar, sem alterar a qualidade imediata da amostra; para obtenção de características espermáticas desejáveis e duradouras, as amostras armazenadas em MM oferecem melhores resultados após 24 horas de resfriamento; o MM com acréscimo de 10 % de fluido prostático adicionado em AEEs submetidas à refrigeração por 24 horas entre 4 - 6 °C não melhora significativamente os parâmetros qualitativos cinéticos, de integridade de membrana plasmática e do percentual de células normais. Já no experimento 3, objetivou-se avaliar a qualidade de AEEs coletadas por FR, submetidas ao processo de seleção em camada única de coloide (SLC) e à adição de 10 % de FP canino, prévio ao resfriamento por até 72 horas entre 4 6 °C. Oito pares de conjuntos testículoepidídimo foram refrigerados durante 24 horas entre 4 6 °C (resfriamento in situ). As AEEs de ambos os epidídimos foram obtidas por FR usando para a perfusão MM e ar, sendo as AEEs associadas posteriormente em uma única amostra. Após avaliações espermáticas, as AEEs de cada animal foram subdivididas e submetidas a dois grupos de centrifugação: G1 AEEs submetidas à SLC, com o coloide Androcoll-C (AC), e G2 AEEs centrifugada com SF; as amostras obtidas em cada grupo foram ressuspendidas com ou sem FP, para preparação dos tratamentos: T1, AEE centrifugada com AC ressuspendida em MM acrescido de 10 % de FP; T2, AEE centrifugada com AC ressuspendida em MM acrescido de 10 % de SF; T3, AEE centrifugada com SF ressuspendida em MM acrescido de 10 % de FP e T4, AEE centrifugada com SF ressuspendida em MM acrescido de 10 % de SF. Após novas avaliações espermáticas os tratamentos foram refrigerados por até 72 horas entre 4 - 6 °C (resfriamento ex situ). Após 24 horas de resfriamento ex situ e após 48 horas adicionais (ou seja, 72 horas desde a coleta das AEEs), foram realizadas avaliações espermáticas nos diferentes tratamentos. As taxas de recuperação espermática foram de 18 e 38 % (para SLC e centrifugação convencional, respectivamente). Não houve diferenças (P>0,05) entre os parâmetros espermáticos antes e após centrifugações. Após 24 horas de resfriamento ex situ foi observada maior MOT no T4 em relação T2, e maior VIG no T3 em relação ao T2 (P<0,05). Após o TTR o T3 e T4 apresentaram performance superior daqueles submetidos à SLC. Após 72 horas de resfriamento ex situ o VIG no T3 foi superior comparado ao T1 e T2 (P<0,05). Os defeitos maiores, menores e totais foram menores em ao menos um dos tratamentos submetidos a SLC (P<0,05). Diante dos resultados obtidos, conclui-se que a perfusão por FR com adição de ar permite a obtenção de AEEs com características espermáticas aceitáveis; a taxa de recuperação é maior nas AEEs centrifugadas com SF do que a obtida após SLC, porém, a SLC previne o aumento de patologias espermáticas após 72 horas de resfriamento; já o acréscimo de 10 % de FP no MM não tem efeito sobre as AEEs nas condições amostradas; as AEEs resfriadas por 24 horas in situ e por até 72 horas ex situ entre 4 - 6 ° C apresentam parâmetros espermáticos compatíveis para utilização em programas de reprodução, com uso potencial em carnívoros silvestres.

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This work was carried out to evaluate the efficiency of sperm selection in ejaculated and epididymal samples of domestic dogs and to verify the effect of the addition of prostatic fluid in epididymal samples, prior to cooling. Three experiments were carried out. In experiment 1, the objective was to test the efficiency of the modified swim-up sperm selection technique adding a commercial colloid (Androcoll-C) (SU-AC), performed in different formats and degree of slant of the migration tube, in an attempt to increase recovery rates and sperm quality in fresh canine semen. Fifteen seminal samples obtained from three different dogs were submitted to the following treatments: T0-Control: semen diluted in commercial diluent; T1: SU-AC in Falcon tube, vertically positioned; T2: SU-AC in round base tube, vertically positioned and T3: SUAC in round base tube, positioned at 45°; after 3' T2 and T3 were evaluated and another medium aliquot was replaced and evaluated 30 minutes later, constituting the treatments T2a and T3a, respectively. There were no differences in sperm recovery rates, total sperm defects, plasma membrane integrity and acrosomal membrane integrity between treatments (P>0.05); there was a decrease in kinetic parameters, regardless of the shape of the migration tube and its slope in relation to T0 (P<0.05); in a vertical position, the tube shape did not show differences in seminal evaluations (P>0.05); there was a decrease in the spermatic pathologies when the slant rounded base tube was used, verified in the 30 min evaluation after the renewal of the medium. It is concluded that there is no improvement of the kinetic parameters evaluated after the SU-AC technique; sperm recovery rates and cell integrity are not influenced by the use of migration tubes of different shapes and slope during the SU-AC technique; the SU-AC allows to obtain a smaller number of spermatic pathologies, when performed in a rounded and inclined base migration tube, with renewal of the medium in the migration tube with recovery and evaluation at 30 min. In the experiment 2, the objective was to verify the effect of the addition of prostatic fluid (PF) on epididymal sperm samples (ESS), cooled for 24 hours, at 4 - 6 ° C, obtained through a retrograde flow (RF) using a commercial maintenances medium (MM) and saline solution (SS). ESS were obtained from eight pairs of testis-epididymis sets by the RF technique with infusion of MM or SS with addition of air. The ESS were standardized to 50 x 106 spermatozoa / mL in MM (T1); the samples collected with SS were subdivided into three aliquots, witch one of them was adjusted to 50 x 106 spermatozoa / mL in SS (T2); another aliquot was adjusted to 50 x 106 spermatozoa / mL with MM plus 10 % SS (T3); and the third aliquot was adjusted to 50 x 106 spermatozoa / mL with MM plus 10 % PF (T4). During 24 hours the treatments were cooled at 4 - 6 ° C and later evaluated for sperm motility (MOT), sperm vigor (VIG), sperm morphology, functional integrity of the plasma membrane and thermoresistance test (TRT). There was no effect (P>0.05) of MM or SS, on the quantity and quality of newly collected spermatozoids; however, the preservation of the samples in the presence of MM during the cooling, favorably influenced (P<0.05) in the MOT, VIG and longevity of the samples. Functional integrity of the plasma membrane and spermatic pathologies did not show differences (P>0.05) after cooling. When evaluating the influence of the 10 % PF addition to the MM, no significant differences (P>0,05) were observed in the evaluated parameters. It is concluded that the RF technique for canine sperm retrieval can be performed by infusion of SS or MM with addition of air, without altering the immediate quality of the sample; to obtain desirable and long lasting sperm characteristics, samples stored in MM give better results after 24 hours of cooling; the MM with a PF 10% added in EES subjected to refrigeration for 24 hours between 4 - 6 ° C does not significantly improve the kinetic parameters, plasma membrane integrity and the percentage of normal cells. In the experiment 3, the objective was to evaluate the quality of ESS collected by RF, submitted to the single-layer centrifugation process through colloid (SLC) and sensitization with PF prior to cooling for up to 72 hours at 4 - 6 ° C. Eight pairs of testis-epididymis were refrigerated for 24 hours at 4 - 6 ° C (in situ). The ESS of both epididymis were obtained by RF using MM and air for perfusion and were later associated in a single sample. After sperm evaluation, the ESS of each animal were subdivided and submitted to two groups of centrifugation: G1 - ESS submitted to SLC with Androcoll-C (AC), and G2 - ESS centrifuged with SS; the samples obtained in each group were resuspended with or without PF to prepare the treatments: T1, ESS centrifuged with AC resuspended in MM plus 10 % PF; T2, ESS centrifuged with AC resuspended in MM plus 10 % SS; T3, ESS centrifuged with SS resuspended in MM plus 10 % PF and T4, ESS centrifuged with SS resuspended in MM plus 10 % SS. After further sperm evaluations, the treatments were refrigerated for up to 72 hours at 4 - 6 ° C (ex situ). After 24 hours of cooling and after an additional 48 hours (resulting in 72 hours from the collection of ESS), sperm evaluation of each treatment was performed. Sperm recovery rates were 18 and 38% (for SLC and conventional centrifugation, respectively). There were no differences (P>0.05) between the sperm parameters before and after centrifugations. After 24 hours of cooling, it was observed higher MOT in T4 in relation to T2, and higher VIG in T3 with respect to T2 (P <0.05). After TRT, T3 and T4 presented higher performance than those submitted to SLC. After 72 hours of cooling VIG at T3 was higher compared to T1 and T2 (P<0.05). The major, minor and total defects were lower in at least one of the treatments submitted to SLC (P<0.05). Thus, perfusion by RF with addition of air allow to obtain ESS with acceptable sperm characteristics; the recovery rate is higher in ESS centrifuged with SS than that obtained after SLC; however, SLC prevent the increase of sperm pathologies after 72 hours of cooling; yet, the increase of 10 % of PF in the MM has no effect on the ESS in this experimental conditions; the ESS cooled for 24 hours in situ and up to 72 hours ex situ between a 4 - 6 ° C have compatible sperm parameters for use in reproduction programs, with potential use in wild carnivores.

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