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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213914

Resumo

A insulina pode desempenhar, no cultivo in vitro, efeitos sobre a foliculogênse os quais permitiram uma maior obtenção de folículos pré-antrais para posterior produção de embrião. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi determinar o efeito do hormônio insulina sobre o cultivo in vitro de fragmentos ovarianos da espécie ovina, associando ou não com FSH. Para ovários foram coletados em matadouros e armazenados em meio MEM-HEPES a 4 °C e levados ao laboratório. Para o cultivo in vitro, foram obtidos fragmentos do córtex ovariano (3x3x2mm) e cultivados em meio -MEM+ por 8 dias a 39°C com 5% de CO2. Após os cultivos os fragmentos foram processado e analisados na histológica para avaliação morfológica do desenvolvimento folicular (ativação, manutenção da morfologia e diâmetro do oócito e folículo), análise imuno-histoquímica para localização do antígeno de proliferação nuclear e expressão gênica do RNA mensageiro mRNA para o gene apoptótico (caspase 3) e da esteroidogênese (CYP17 e CYP19). O fluxo de informação permitiu separar o estudo em dois experimentos. Experimento 1: Cultivo in vitro dos tecidos, avaliando os efeitos do hormônio insulina nas concentrações de (0, 1, 10, 100, 1.000 e 10.000 ng/mL), sobre a ativação, desenvolvimento e manutenção da morfologia. Experimento 2: Cultivo in vitro com hormônio insulina (0, 1, 100 ng/mL) associada com FSH sobre a ativação, desenvolvimento, manutenção da morfologia, antígeno de proliferação nuclear (PCNA) e expressão dos genes caspase 3, CYP17 e CYP19. No experimento 1 os resultados demonstraram que: Os maiores percentuais de ativação foram observados nas concentrações de 1 e 100 ng/mL do hormônio (P < 0,05), a porcentagem de folículos morfologicamente normais foi significativamente maior (P< 0,05) para os tecidos cultivados em 1 e 10 ng/mL de insulina comparado aos tecidos cultivados apenas em -MEM+. Com relação ao crescimento não foi observada diferença do diâmetro do oócito e folículo após o cultivo in vitro em nenhuma das concentrações da insulina. Entretanto na concentração de 10,000 ng/mL houve uma redução significativa no diâmetro folicular quando comparado aos tecidos cultivados apenas em -MEM+ (P < 0,05). No experimento 2: Os resultados demonstraram que após 8 dias de cultivo com as concentrações de insulina (1, 10 e 100 ng/mL) associado com FSH, apresentaram uma maior ativação (P < 0,05). Do mesmo modo, a porcentagem de folículos morfologicamente normais foi significativamente maior na concentração de 10 ng/mL com e sem FSH (P < 0,05). A marcação do PCNA pela imunohistoquímica demonstrou a presença do antígeno no oócito, em todos os grupos analisados, e nas células da granulosa, apenas no grupo que não foi submetido ao cultivo. A porcentagem de pixel para a marcação do PCNA em todas as concentrações de insulina associada ao FSH, foi maiores que os grupos sem FSH (P<0,05). A expressão dos genes CYP17 e CYP19 foram identificada em todos os grupos, entretanto sem diferença significativa. A expressão do gene caspase 3 no grupo IN1FSH (P < 0,05) do que nos grupos IN10, IN100, IN10FSH e IN100FSH. Em conclusão a insulina no cultivo in vitro de fragmentos ovarianos de ovelhas, sozinha ou associada com FSH atua de forma dose-dependente na ativação folicular, preservando a morfologia, mas sem alterar o diâmetro folicular. Em alta concentração (10.000 ng/mL) a insulina possui efeito inibitório sobre o crescimento inicial dos folículos. Conclui-se, ainda, que a insulina pode reduzir a expressão do gene relacionado com a apoptose (caspase 3), quando em concentrações intermediárias (10 e 100 ng/mL) especialmente associados ao FSH.

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Insulin may have effects on folliculogenesis in in vitro culture, which allowed a greater preantral follicles to be obtained for later embryo production. In this context, the objective of this work was to determine the effect of the hormone insulin on the in vitro culture of ovarian fragments of the ovine species, associated or not with FSH. For ovaries were collected in slaughterhouses and stored in MEM-HEPES medium at 4 ° C and taken to the laboratory. For in vitro culture, fragments of the ovarian cortex (3x3x2mm) and cultured in -MEM + medium were obtained for 8 days at 39 ° C with 5% CO2. After culture, the fragments were processed and histologically analyzed for morphological evaluation of follicular development (activation, maintenance of the morphology and diameter of the oocyte and follicle), immunohistochemical analysis for localization of the nuclear proliferation antigen and gene expression of mRNA messenger RNA for the apoptotic gene (caspase 3) and steroidogenesis (CYP17 and CYP19). The flow of information allowed to separate the study in two experiments. Experiment 1: In vitro culture of the tissues, evaluating the effects of the hormone insulin at the concentrations of (0, 1, 10, 100, 1.000 and 10.000 ng/mL) on the activation, development and maintenance of morphology. Experiment 2: In vitro culture with hormone insulin (0.1, 100 ng/mL) associated with FSH on the activation, development, maintenance of morphology, nuclear proliferation antigen (PCNA) and expression of caspase 3, CYP17 and CYP19 genes. In the experiment 1 the results showed that: The highest percentages of activation were observed at concentrations of 1 and 100 ng/mL of the hormone (P <0.05), the percentage of morphologically normal follicles was significantly higher (P <0.05) for tissues cultured in 1 and 10 ng / mL insulin compared to tissues cultured only in -MEM+. Regarding growth, no difference in oocyte and follicle diameter was observed after in vitro culture at any of the insulin concentrations. However, at the concentration of 10,000 ng / mL there was a significant reduction in follicular diameter when compared to tissues cultured only in -MEM+ (P <0.05). In the experiment 2, the results showed that after 8 days of culture with insulin concentrations (1, 10 and 100 ng / mL) associated with FSH, they presented a greater activation (P<0.05). Likewise, the percentage of morphologically normal follicles was significantly higher at 10 ng / mL concentration with and without FSH (P <0.05). The PCNA labeling by immunohistochemistry showed the presence of the antigen in the oocyte, in all the analyzed groups, and in the granulosa cells, only in the group that was not submitted to the culture. The percentage of pixel for PCNA labeling at all FSH associated insulin concentrations was higher than the non FSH groups (P <0.05). The expression of the CYP17 and CYP19 genes were identified in all groups, however without significant difference. The expression of the caspase 3 gene in the IN1FSH group (P <0.05) than in the IN10, IN100, IN10FSH and IN100FSH groups. In conclusion, insulin in the in vitro culture of ovarian sheep fragments alone or associated with FSH acts in a dosedependent manner on follicular activation, preserving the morphology, but without altering the follicular diameter. At high concentration (10,000 ng/mL) insulin has an inhibitory effect on the initial follicle growth. It is also concluded that insulin can reduce the expression of the gene related to apoptosis (caspase 3), when in intermediate concentrations (10 and 100 ng/mL) especially associated with FSH.

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