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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216435

Resumo

A gastroenterite em leitões lactentes e recém-desmamados representa a principal causa de morbidade e mortalidade durante o período neonatal. A síndrome é caracterizada por infecção entérica multifatorial e multietiológica. Entre as causas infecciosas, o rotavírus (RV) é o principal agente etiológico viral. Por serem mais frequentes, as espécies de rotavírus A (RVA) e C (RVC) são as mais estudadas. No entanto, surtos de diarreia causados por espécies de rotavírus B (RVB) em leitões lactentes estão sendo relatados em rebanhos de suínos das regiões sul e centro-oeste do Brasil. Por sua vez, a espécie de rotavírus H (RVH) foi descrita apenas recentemente na suinocultura brasileira. Os objetivos deste estudo foram avaliar a presença de cepas de RV em um surto de diarreia em leitões lactentes e recém-desmamos que ocorreu em uma granja com programa de vacinação contra patógenos entéricos, incluindo RVA, e realizar a caracterização molecular das cepas de RVB e RVH identificadas. Para isso, três estudos independentes foram realizados. O objetivo do primeiro estudo foi determinar as sequências de nucleotídeos (nt) e de aminoácidos (aa) dos genes que codificam as proteínas VP6, VP7, VP4 e NSP4 de seis cepas de campo identificadas como RVH (BR59, BR60, BR61, BR62, BR63 e BR64) no surto de diarreia. A partir da cepa de RVH suína, SKA-1, primers específicos foram selecionados para amplicação dos genes citados acima. Com base nas altas identidades encontradas entre as sequências de nt (~99%) dos genes VP6, VP4, VP7 e NSP4 entre cinco das cepas estudadas (BR59 a BR63), é possível considerá-las pertencentes a mesma linhagem de RV, denominada RVH / BRA-1. Em contraste, uma vez que a amostra fecal BR64 apresentou uma diferença relativamente alta (81,6% e 83,4% de identidade para nt e aa, respectivamente) na sequência referente à proteína VP7, quando comparada com as outras cinco amostras, a mesma foi denominada cepa RVH / BRA-2. No segundo estudo, com o objetivo de triar todas as amostras diarreicas (n = 50) obtidas no surto para RVA, B, C e H, realizou-se RT-PCR com primers específicos para cada espécie. De acordo com os testes, RVC (78%) foi mais prevalente nas infecções singulares (34%) e mistas (44%), seguido pelo RVA (46%), RVB (32%) e RVH (18%). A análise filogenética de três cepas de RVA permitiu a caracterização de dois genotipos G / P distintos, representados por G5P[13] e G9P[23], diferentemente do G5P[7] presente em vacinas comerciais. Independentemente da espécie de RV, as infecções mistas (54%) foram mais prevalentes do que as infecções por um único agente. RVB e RVH foram detectados apenas em associação com outros grupos de RV, sugerindo uma ação secundária dessas espécies no surto relatado. Finalmente, no terceiro estudo, com base na qualidade do produto amplificado por RT-PCR, a amostra fecal de RVB identificada como BR62, foi selecionada para análises moleculares adicionais. As sequências de nt e aa do gene VP7 foram determinadas e a análise comparativa desta cepa com as cepas dos outros 21 genotipos de VP7 previamente identificados mostraram que a cepa suína brasileira pertence a um novo genotipo, G22, e parece estar circulando em diferentes partes do mundo. Os estudos reforçam o papel dos RV como importantes agentes causadores de diarreia demonstram a variabilidade genética entre as espécies. Além disso, esta é a primeira detecção do genotipo de RVB, G22, em rebanhos suinícolas brasileiros.

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Gastroenterits in suckling and newly weaned piglets represents the major cause of morbidity and mortality during the neonatal period. The syndrome is a multifactorial and multi etiologic enteric infection. Among the infectious causes, rotavirus (RV) is the main viral etiologic agent. To be more frequent rotavirus species A (RVA) and C (RVC) are most studied. However, outbreaks of diarrhea caused by rotavirus species B (RVB) in suckling piglets are being reported from pig herds of the southern and midwest regions of Brazil. The rotavirus species H (RVH) was only recently described in Brazilian pig farming. The aims of this study was to evaluate the presence of RV strains in suckling and newly post-weaning diarrhea outbreak that occurred in a pig farm with vaccination program against enteric pathogens, including RVA, and perform the molecular characterization of RVB and RVH field strains identified in this diarrhea outbreak. For this, three independent studies were carried out. The objective of the first study was to determine the VP6, VP7, VP4, and NSP4 nucleotide (nt) and amino acid (aa) sequences of six (BR59, BR60, BR61, BR62, BR63, and BR64) RVH field strains identified in the diarrhea outbreak. Specific primers were designed based on the porcine RVH strain SKA-1. Based on the high nt sequence identities (~99%) of the VP6, VP4, VP7, and NSP4 genes among five of the studied specimens (BR59 to BR63), they are considered the same local RV strain denominated RVH/BRA-1. In contrast, once that the fecal sample BR64 showed a relatively high difference (81.6% nt identity and 83.4% aa identity) in the VP7 sequence when compared to the other five specimens it was named RVH/BRA-2 strain. On the second study, with the objective of screening all the diarrheic samples (n = 50) obtained from the outbreak for RVA, B, C, and H, RT-PCR with specific primers were performed. RVC (78%) was the most prevalent group found in single (34%) and mixed (44%) infections, followed by RVA (46%), RVB (32%), and RVH (18%). Phylogenetic analysis of three RVA strains allowed the characterization of two distinct G/P genotypes represented by G5P[13] and G9P[23], different from G5P[7] present in commercial vaccines. Regardless of the RV group, mixed infections (54%) were more prevalent than single infections. Detection of RVB or RVH was associated with the presence of other RV groups, suggesting a secondary action of these RV groups in the reported outbreak. Finally, in the third study, based on the quality of the RT-PCR amplified product, the RVB-positive fecal sample identified as BR62 was selected for further molecular analyses. The VP7 nt and deduced aa sequences were determined and comparative analysis of this strain with the strains of the other 21 previously identified VP7 genotypes showed that the Brazilian porcine RVB strain belongs to a novel G22 VP7 genotype, and seems to be circulating in different parts of the world. The studies reinforce the rule of RV as important diarrhea agents and contribute to show the genetic variability among the species. Additionally, this is the first detection of RVB G22 genotype in Brazilian pig herds.

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