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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216702

Resumo

Senecavirus A (SVA) é a única espécie do gênero Senecavirus, família Picornaviridae. SVA é um vírus RNA fita simples, de polaridade positiva, não envelopado e genoma com aproximadamente 7,2 kb. Desde 2007, SVA tem sido associado à doença vesicular em suínos nos Estados Unidos da América, Brasil, Colômbia, China e Tailândia. A partir de 2015, uma nova síndrome multissistêmica associada à infecção por SVA tem sido relatada em leitões recém-nascidos nesses países. SVA foi identificado por técnicas moleculares (RT-PCR, qRT-PCR e nested-RT-PCR), imuno-histoquímica e/ou hibridização in situ em diferentes órgãos de leitões recém-nascidos. Embora a RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) tenha sido utilizada para detectar RNA de SVA a partir de amostras biológicas de suínos, não há relatos da determinação da carga viral nos diferentes tecidos de leitões recém-nascidos com sinais clínicos consistentes com a infecção pelo vírus. O objetivo deste estudo foi avaliar a distribuição tecidual e a carga viral de SVA em diferentes amostras biológicas de leitões sintomáticos, naturalmente infectados, provenientes de rebanhos suínos com histórico de doença vesicular. No primeiro estudo foi validado um teste de qRT-PCR utilizando TaqMan como ferramenta para a detecção e quantificação de RNA de SVA em amostras biológicas de suínos. Um conjunto de primers e probe específicos para amplificar um produto de 118 pb da região VP1 do genoma do vírus foi desenhado para ser utilizado na técnica de qRT-PCR. A avaliação da eficiência da qRT-PCR TaqMan foi realizada em 45 amostras de tecidos de 15 leitões sintomáticos (n = 38) e quatro (n = 7) assintomáticos previamente caracterizados como positivos ou negativos para SVA por RT-PCR convencional. Entre amostras biológicas provenientes de leitões sintomáticos, 18 (47,4%) e 30 (78,9%) foram positivas por RT-PCR convencional e qRT-PCR, respectivamente. Todas as amostras obtidas de leitões assintomáticos foram negativas para o vírus em ambas as técnicas utilizado. Os resultados demonstram que a técnica de qRT-PCR utilizando TaqMan padronizada neste estudo é rápida e apresenta alta sensibilidade, especificidade e repetibilidade, sendo capaz de gerar resultados confiáveis na detecção e quantificação de RNA de SVA em amostras biológicas de suínos. O segundo estudo avaliou a distribuição e a carga viral de SVA em diferentes amostras de órgãos/tecidos provenientes de leitões recém-nascidos sintomáticos. Por meio da técnica qRT-PCR previamente padronizada no primeiro estudo, foram analisados fragmentos de tronco encefálico, cerebelo, cérebro, coração, rim, fígado, pulmões, intestino delgado, baço, bexiga e tonsila provenientes de sete leitões recém-nascidos. O RNA de SVA foi detectado em 81,4% (57/70) das amostras avaliadas. A carga viral variou de 4,07 a 10,38 log10 cópias genômicas/g de tecido. Os resultados demonstram que o SVA tem tropismo por diferentes órgãos em leitões recém-nascidos naturalmente infectados, principalmente tonsilas, baço, pulmão e fígado. Órgãos linfoides apresentam altas cargas virais e podem ser importantes sítios de replicação de SVA. A ampla distribuição de RNA de SVA em órgãos/tecidos dos sistemas cardiovascular, respiratório, digestório, urinário, neurológico e linfático demonstra a capacidade do vírus em causar infecção multissistêmica em leitões recém-nascidos e a sua participação nas manifestações clínicas observadas.

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Senecavirus A (SVA) is the only member of the Senecavirus genus, Picornaviridae family. SVA is a single-stranded, positive-sense, non-enveloped RNA virus with a genome size of approximately 7.2 kb. Since 2007 reports have revealed SVA-associated vesicular disease in pigs in the USA, Brazil, China, Colômbia, and Thailand. From 2015, a novel multisystemic syndrome associated with SVA infection has been reported in newborn piglets from these countries. SVA was detected by techniques such as molecular (RT-PCR, qRT-PCR and nested-RT-PCR), immunohistochemical, and/or in situ hybridization assays in different organs/tissues of newborn piglets. Although quantitative RT-PCR (qRT-PCR) assays have been used to detect the SVA genome from organ samples of piglets, there are no reports of the SVA RNA loads in tissues of newborn piglets with clinical signs consistent with SVA infection. The aim of this study was evaluate the SVA distribution and RNA loads in different biological samples of naturally infected symptomatic piglets originating from vesicular disease-affected pig herds. In the first study a TaqMan-based qRT-PCR assay was validated for SVA RNA detection and quantification in biological porcine specimens. A set of specific primers and probe was designed to amplify a 118 bp length fragment within the VP1 gene of the SVA genome. The efficiency of TaqMan-based qRT-PCR was evaluated in 45 tissue samples of 15 symptomatic (n = 38) and 4 (n = 7) asymptomatic piglets, previously caracterized as positive or negative for SVA by conventional RT-PCR. Among the biological samples of symptomatic piglets, 18 (47.4%) and 30 (78.9%) were positive for SVA in conventional RT-PCR and qRT-PCR assays, respectively. All samples obtained from asymptomatic piglets were negative for the virus in both assays. The results demonstrated that the TaqMan-based qRT-PCR assay in this study is a rapid technique with high sensitivity, specificity and reproducibility, able to generate reliable results to simultaneously detect and quantify SVA RNA in porcine biological samples. The second study determined the SVA RNA distribution and loads in different organs/tissues from symptomatic newborn piglets. Using the qRT-PCR assay previously developed in the first study, fragments of brainstem, cerebellum, cerebrum, heart, kidney, liver, lungs, small intestine, spleen, urinary bladder, and tonsils of seven newborn piglets were analyzed. SVA was detected in 81.4% (57/70) of the tissue samples. Viral loads ranged from 4.07 to 10.38 log10 genomic copies/g of tissue. The results show that SVA has tropism for different organs in naturally infected newborn piglets, mainly tonsils, spleen, lungs, and liver. Lymphoid organs contained the highest viral loads and may be important sites for SVA replication. The wide SVA RNA distribution in organs/tissues of the cardiovascular, repiratory, digestive, urinary, neurological, and lymphatic systems demonstrate the virus ability to cause multisystemic infection in newborn piglets and the participation of SVA in the observed clinical manifestations.

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