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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216846

Resumo

Embora a produção in vitro de embriões (PIVE) tenha sido uma ferramenta muito utilizada para a multiplicação de bovinos geneticamente superiores, vários estudos já demonstraram que as condições de cultivo podem influenciar o sucesso da técnica. Além disso, em condições de campo torna-se interessante equipamentos portáteis que possam facilitar o transporte de oócitos/embriões nas condições mais favoráveis. Assim, este trabalho teve por objetivo verificar a eficiência da PIVE bovina em três diferentes sistemas de incubação: incubadora convencional de bancada (CONV), mini-incubadora de bancada (MINI) e mini-incubadora portátil (PORT). Para tanto, complexos cumulus- oócito (CCOs) foram obtidos de ovários de abatedouros e divididos aleatoriamente em três grupos: CONV com oxigênio elevado (5% CO2), MINI e PORT, ambas com baixa tensão de oxigênio (5% CO2, 5% O2 e 90% N2), e submetidos à maturação in vitro (MIV) por 22 h. Após a MIV, parte dos CCOs foi submetida à marcação com Hoechst 33342 para avaliação da taxa de maturação. As estruturas restantes foram submetidas à fecundação in vitro (FIV) por 6 h seguido de cultivo in vitro (CIV) por 8 dias. A taxa de clivagem foi avaliada no dia dois (D2) e a taxa de blastocistos nos dias sete (D7) e oito (D8) de cultivo. Adicionalmente, oócitos pós-MIV e embriões (D2 e D7) foram corados com H2DCFDA para avaliação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) pela avaliação das unidades arbitrárias de fluorescência (UAFs). As taxas de maturação oocitária, clivagem, blastocistos expandidos/eclodidos e o número total de células por blastocisto foram avaliadas por ANOVA one-way, enquanto os níveis de EROs pelo teste de Kruskal-Wallis. O nível de significância foi de 5%. Não foi observada diferença significativa (P > 0,05) quanto à taxa de maturação (70,4%, 50,8% e 57,6% para CONV, MINI e PORT, respectivamente). Quanto à taxa de clivagem, o sistema CONV (74.0%) resultou na maior porcentagem (P < 0,05) quando comparado ao sistema PORT (59,5%), mas similar ( P > 0,05%) ao sistema MINI (65,0%). O mesmo padrão e diferença significativa foi observado para taxa de blastocistos em D7: CONV (33,3%), MINI (32,3%) e PORT (21,9%). Em relação aos níveis de EROs (UAFs EPM), os oócitos pós-MIV não mostraram diferença significativa (P > 0,05) quando da comparação dos grupos CONV (35,6 ± 4,5), MINI (29,4 ± 4,0) e PORT (35,6 ± 4,5). Para embriões D2, os níveis de EROs foram mais altos (P < 0,05) no grupo MINI (44,2± 3,1) em comparação ao CONV (27,7 ± 3,7) e PORT (33,3 ± 3,2). Todavia, nenhumadiferença significativa (P > 0.05) foi observada em embriões D7: 45,0 ± 3,5; 48,1 ± 3,9 e 43,3 ± 3,3 para CONV, MINI e PORT, respectivamente. Concluindo, o sistema PORT foi capaz de obter embriões de PIVE embora não eficientemente como o CONV. Adicionalmente, embora um elevado nível de EROs foi observado em embriões D2 do sistema MINI, este foi tão eficiente quanto o CONV na produção de blastocistos. Tal sistema pode ser uma opção mais econômica para a indústria de embriões bovinos produzidos in vitro.

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Although embryo in vitro production (IVP) has been a widely used tool for the multiplication of genetically superior cattle, several studies have already shown that culture conditions may influence the success of the technique. Moreover, in field conditions it becomes interesting portable equipment that can facilitate the transport of oocytes / embryos under the most favorable conditions. The objective of this study was to verify the efficiency of bovine IVP in three different incubation systems: conventional bench incubator (CONV), bench mini-incubator (MINI) and portable mini-incubator (PORT). The cumulus-oocyte complexes (COCs) were obtained from slaughterhouses ovaries and randomly divided into three groups: CONV with high oxygen (5% CO2), MINI and PORT, both with low oxygen tension (5% CO2, 5% O2 and 90% N2), and submitted to in vitro maturation (IVM) for 22 h. After IVM, part of the COCs was subjected to Hoechst 33342 labeling to evaluate the maturation rate. The remaining structures were submitted to in vitro fertilization (IVF) for 6 h followed by in vitro culture (IVC) for 8 days. The cleavage rate was assessed on day two (D2) and the rate of blastocysts on days seven (D7) and eight (D8) culture. The cleavage rate was assessed on day two (D2) and the rate of blastocysts on days seven (D7) and eight (D8) culture. In addition, post-IVM oocytes and embryos (D2 and D7) were stained with H2DCFDA to evaluate the levels of reactive oxygen species (ROS) by the evaluation of arbitrary fluorescence units (AFUs). The rates of oocyte maturation, cleavage, expanded/hatched blastocysts and the total number of cells per blastocyst were evaluated by one-way ANOVA, while the levels of ROS by the Kruskal-Wallis test. The level of significance was 5%. No significant difference (P > 0.05) was observed in the maturation rate (70.4%, 50.8% and 57.6% for CONV, MINI and PORT, respectively). Regarding the cleavage rate, the CONV system (74.0%) resulted in the highest percentage (P < 0.05) when compared to the PORT system (59.5%), but similar (P > 0.05%) to the MINI system (65.0%). The same pattern and significant difference was observed for the rate of blastocysts in D7: CONV (33.3%), MINI (32.3%) and PORT (21.9%). Regarding the ROS levels (AFUs ± SEM), post-IVM oocytes did not show a significant difference (P > 0.05) when comparing CONV (35.6 ± 4.5), MINI (29.4 ± 4.0) and PORT (35.6 ± 4.5). For D2 embryos, ROS levels were higher (P < 0.05) in the MINI group (44.2 ± 3.1) compared to CONV (27.7 ± 3.7) and PORT (33.3± 3.2). However, no significant difference (P > 0.05) was observed in D7 embryos: 45.0 ± 3.5; 48.1 ± 3.9 and 43.3 ± 3.3 for CONV, MINI and PORT, respectively. In conclusion, the PORT system was able to obtain IVP embryos although not efficiently as the CONV. In addition, although a high level of ROS was observed in D2 embryos of the MINI system, it was as efficient as the CONV in the production of blastocysts. Such a system may be a more economical option for the in vitro produced bovine embryo industry.

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