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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-217031

Resumo

A enzima frutosiltransferase (FTase) é responsável pela hidrólise da sacarose e também pela transferência de oligômeros de frutose para a formação dos frutooligossacarídeos (FOS). Os FOS estão inclusos no grupo dos prebióticos, apresentam baixas calorias, não cariogénicos, estimulam o crescimento de bactérias benéficas presentes na microbiota intestinal, também são inseridos em rações para animais. Os fungos filamentosos são a principal fonte de obtenção da FTase, mas, ainda há necessidade de buscar novas fontes microbianas, bem como métodos de produção e purificação com maiores rendimentos e menor custo. O objetivo deste trabalho foi selecionar, produzir, purificar a enzima FTase e sintetizar frutooligossacarídeos. Foi selecionado por fermentação em estado sólido utilizando farelo de trigo como substrato, linhagens de Aspergillus spp. isoladas da Caatinga. Um planejamento fatorial fracionário 25-1 foi realizado a fim de selecionar a melhor condição de produção da FTase. Em seguida, a FTase foi pré-purificada em sistema de duas fases aquosas (SDFA) utilizando um planejamento fatorial 24. A etapa final do processo de purificação foi através do sistema rápido de cromatografia (FPLC) em coluna de gel filtração. Na caracterização enzimática foi determinado o pH e temperatura ótima, bem como a estabilidade ao pH e temperatura; influência de íons metálicos. Aspergillus tamarii Kita UCP 1279 destacou-se como melhor produtor (42,71 U/mL), na análise estatística do planejamento fatorial, as variáveis umidade e foto período foram significavas e com efeito positivo na produção de FTase. A condição selecionada foi 20% de sacarose, 106 esporos/mL, 70% de umidade, foto período de 12 horas, a temperatura de 30°C e no tempo de 48 horas de cultivo. Na pré-purificação por SDFA a enzima FTase apresentou afinidade para a fase rica em sal com 12,39 U/mL de atividade enzimática, nas condições: massa molar do PEG (400g/mol), concentração de 24% (m/m), concentração de citrato de sódio a 20% (m/m) e pH 8, obtendo um fator de purificação de 6,42; coeficiente de partição de 0,37 e rendimento de 352,78%. A FTase pré-purificada foi aplicada no FPLC, e após duas injeções foi visualizado dois picos, onde apenas um pico apresentou atividade e seu peso molecular de aproximadamente 106,90 KDa. A caracterização bioquímica da FTase do extrato bruto apresentou pH ótimo 5,0 e temperatura ótima de 60ºC, estabilidade ao pH 7 e em temperaturas abaixo de 50ºC. Em relação à enzima pré-purificada por SDFA, o pH ótimo foi 5,0 e a temperatura ótima de 55 ºC, enquanto a estabilidade foi ao pH 5 e a estabilidade térmica em temperaturas abaixo de 50ºC. Os íons CuSO4 e FeSO2 inibiram totalmente a atividade enzimática do extrato bruto, em todas as concentrações e o FeCl3 inibiu totalmente nas maiores concentrações e os demais íons estudados inibiram parcialmente em todas as concentrações. O efeito de íons na enzima pré-purificada foi de ativação, destacando MgSO4 com atividade residual de 191%. No entanto, dois íons apresentaram inibição total na maior concentração testada, FeCl3 e CuSO4. A síntese de FOS foi realizada com a enzima nas três condições estudadas (extrato bruto, pré-purificada e pura), onde foram identificados dois frutooligossacarídeos, Kestose e Nistose. Foi descoberta uma nova frutosiltransferase produzida por Aspergillus tamarii Kita UCP 1279, com características bioquímicas desejáveis para síntese de FOS, bem como o processo de purificação de FTase utilizando a junção das técnicas de SDFA e cromatografia de forma eficiente.

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The frutosyltransferase (FTase) enzyme is the responsible for sucrose hydrolysis and for fructose oligomers transfer to form fructooligosaccharides (FOS). FOS are included in the group of prebiotics, formed by fructose oligomers. They are low in calories, are non-cariogenic, stimulate the growth of desirable bacteria present in the intestinal microbiota so they are also used in animal feed. Filamentous fungi are the main source of FTase, but there is still a need to seek out new microbial sources as well as production and purification methods with higher yields and lower costs. The aim of this work was to select, produce, purify the enzyme FTase and synthesize fructooligosaccharides. It was selected by solid state fermentation using wheat bran as substrate, Aspergillus spp. isolated from the Caatinga. A fractional factorial design 25-1 was performed in order to select the best FTase production condition. Then, the FTase was pre-purified in an aqueous two-phase system (ATPS) using a factorial design 24. The final step of the purification process was through the rapid chromatography system (FPLC) on a gel filtration column. In the enzymatic characterization the pH and optimum temperature were determined, as well as the stability at pH and temperature; influence of metal ions Aspergillus tamarii Kita UCP 1279 was the best producer (42.71 U/mL), in the statistical analysis of factorial planning, the variables moisture and photo period were significant and had a positive effect on FTase production. The selected condition was 20% sucrose, 106 spores / mL, 70% moisture, photo period of 12 hours, the temperature of 30°C and the time of 48 hours of culture. In the pre-purification by ATPS, the enzyme FTase showed affinity for the salt-rich phase with 12.39 U/mL of enzymatic activity, under the conditions: PEG molar mass (400g/mol), 24% , 20% (w/w) sodium citrate concentration and pH 8, obtaining a purification factor of 6.42; partition coefficient of 0.37 and yield of 352.78%. The pre-purified FTase was applied to the FPLC, and after two injections two peaks were visualized, where only one peak had activity and its molecular weight was approximately 106.90 KDa. The biochemical characterization of the crude extract FTase presented optimum pH 5.0 and optimum temperature of 60ºC, stability at pH 7 and at temperatures below 50ºC. In relation to the enzyme pre-purified by SDFA, the optimum pH was 5.0 and the optimum temperature was 55°C, while stability was at pH 5 and thermal stability at temperatures below 50°C. The CuSO4 and FeSO2 ions completely inhibited the enzymatic activity of the crude extract at all concentrations and FeCl3 completely inhibited at higher concentrations and the other ions studied partially inhibited at all concentrations. The effect of ions on the pre-purified enzyme was activation, highlighting MgSO4 with residual activity of 191%. However, two ions showed total inhibition at the highest concentration tested, FeCl3 and CuSO4. The synthesis of FOS was performed with the enzyme in the three conditions studied (crude, pre-purified and pure extract), where two fructooligosaccharides, Kestose and Nistose were identified. A new fructosyltransferase produced by Aspergillus tamarii Kita UCP 1279 was discovered, with desirable biochemical characteristics for FOS synthesis, as well as the FTase purification process using the junction of ATPS techniques and chromatography efficiently.

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