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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-220850

Resumo

Com o aumento do potencial de criação equina, biotecnologias reprodutivas se tornam 11 importantes ferramentas na produção, com destaque para a inseminação artificial. 12 Nos protocolos estabelecidos para manutenção do ejaculado são utilizados diluidores 13 que possuem em sua constituição, nutrientes para manter o metabolismo celular, além 14 de substâncias para proteção celular como a gema de ovo, sendo fundamentais para 15 os processos de resfriamento e congelamento. O objetivou deste estudo foi diminuir 16 os tamanhos das partículas da lipoproteína de baixa densidade, através de processos 17 de sonicação no diluente Tris gema para o congelamento das células espermáticas 18 equinas. Nesse experimento foram utilizados 19 animais com idade entre 4 a 8 anos 19 da raça Crioula, a coleta do sêmen foi realizada com o método de vagina artificial. As 20 amostras deveriam apresentar um padrão de motilidade 70% e patologias 30%. Os 21 ejaculados foram testados em 4 tratamentos diferentes: Tratamento 1 (T1) controle 22 Tris-gema; Tratamento 2 (T2) Tris-gema centrifugado três vezes consecutivamente 23 à 10.000 RCF na temperatura de 4ºC/45 min; Tratamento 3 (T3) Tris-gema sonicado 24 por 30 min em amplitude de 50% com ponteira de sonda de 3mm; Tratamento 4 (T4) 25 Tris-gema centrifugado três vezes consecutivamente à 10.000 G na temperatura de 26 4ºC/45 min e sonicado por 30 min em amplitude de 50% com ponteira de sonda de 27 3mm. Posteriormente se realizou o processo de criopreservação com curva de 28 congelamento de 0,5ºC/min até 5ºC, estabilização por 30 min, seguida de adição de 29 crioprotetor e envase em palhetas de 0,5 ml e expostas ao vapor de nitrogênio líquido 30 (-80 º C) por 10 min e congeladas a -196°C. Pós descongelamento se realizou 31 avaliações in vitro de cinética espermática em sistema computadorizado (CASA), e 32 avaliações de integridade estrutural em microscopia de fluorescência para parâmetros 33 de integridade de membrana, DNA e acrossoma e funcionalidade mitocondrial. Para 34 avaliação estatística foi utilizado o programa computacional Statistix 9® (Statistix, 35 Statistix 9 for Windows, Analytical Software, Tallahassee, FL, USA, 2008). O nível de 36 significância foi de p<0,05. O diluente que utilizou a sonicação como alternativa para 37 diminuir as partículas de LDL apresentaram melhora nos parâmetros de motilidade 38 total e progressiva, A funcionalidade de mitocondria não apresentou diferença entre 39 os tratamentos. A percentagem de DNA integro e integridade de acrossoma o controle 40 com tris-gema foi superior aos demais tratamentos. A composição química do LDL é 41 pouco complexa quando comparada a um diluente de gema de ovo, assim, direta ou 42 indiretamente o LDL tem a capacidade de diminuir as alterações na membrana 43 plasmática, e os processos de sonicação promove uma redução na partícula da LDL. 44 Com base nos resultados obtidos neste estudo, o tratamento que obteve resultados 45 similares ao controle em integridade de membrana celular foi o T3, sendo que todos os testados foram superiores ao controle no parâmetro de motilidade total e progressiva.

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With the increase in the potential for equine breeding, reproductive biotechnologies 11 become important tools in production, with emphasis on artificial insemination. In the 12 protocols established for the maintenance of ejaculate, thinners are used that have 13 nutrients to maintain cellular metabolism, in addition to substances for cellular 14 protection such as egg yolk, which are fundamental for the cooling and freezing 15 processes. The objective of this study was to reduce the particle sizes of low density 16 lipoprotein, through sonication processes in the tri-yolk diluent for the freezing of 17 equine sperm cells. In this experiment, 19 Creole animals aged 4 to 8 years were used, 18 semen collection was performed using the artificial vagina method. The samples 19 should show a motility pattern 70% and pathologies 30%. Ejaculates were tested in 20 4 different treatments: Treatment 1 (T1) Tris egg-yolk control; Treatment 2 (T2) Tris 21 egg-yolk centrifuged three times consecutively at 10,000 RCF at a temperature of 4ºC 22 / 45 min; Treatment 3 (T3) Tris egg-yolk sonicated for 30 min in 50% amplitude with a 23 3mm probe tip; Treatment 4 (T4) Tris egg-yolk centrifuged three times consecutively 24 at 10,000 G at a temperature of 4ºC / 45 min and sonicated for 30 min at 50% amplitude 25 with a 3mm probe tip. Subsequently, the cryopreservation process was carried out with 26 a freezing curve of 0.5ºC / min to 5ºC, stabilization for 30 min, followed by the addition 27 of cryoprotectant and filling in 0.5 ml straws and exposed to liquid nitrogen vapor (-80 28 º C) for 10 min and frozen at -196 ° C. After thawing, in vitro evaluations of sperm 29 kinetics were performed in a computerized system (CASA), and structural integrity 30 evaluations under fluorescence microscopy for parameters of membrane integrity, 31 DNA and acrosome and mitochondrial functionality. For statistical evaluation, the 32 computer program Statistix 9® (Statistix, Statistix 9 for Windows, Analytical Software, 33 Tallahassee, FL, USA, 2008) was used. The level of significance was p <0.05. The 34 diluent that used sonication as an alternative to decrease LDL particles showed 35 improvement in the parameters of total and progressive motility. The functionality of 36 mitochondria showed no difference between treatments. The percentage of whole 37 DNA and acrosome integrity in the control with tris egg-yolk was higher than the other 38 treatments. The chemical composition of LDL is not very complex when compared to 39 an egg yolk diluent, thus, directly or indirectly LDL has the ability to decrease changes 40 in the plasma membrane, and the sonication processes promote a reduction in the LDL 41 particle. Based on the results obtained in this study, the treatment that obtained results 42 similar to the control in cell membrane integrity was T3, and all those tested were 43 superior to the control in the parameter of total and progressive motility.

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