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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-220990

Resumo

A diabetes mellitus (DM) tipo 1 é uma doença comum em homens e cães, com complicações sérias e sem cura. Os tratamentos disponíveis apresentam limitações e não mimetizam o controle fisiológico que a secreção de insulina, pelas células beta pancreáticas, exercem na glicemia. Neste contexto, células tronco mesenquimais (CTM) de diferentes espécies têm sido utilizadas para a diferenciação em células beta funcionais. Os cães são utilizados como modelo de estudo da DM tipo 1 humana, devido às suas similaridades quanto à apresentação e ao curso da doença. No entanto, nesta espécie, pouco se sabe sobre a diferenciação in vitro das CTM em células produtoras de insulina (CPI). O objetivo deste estudo foi diferenciar células tronco mesenquimais do tecido adiposo (CTM-TA) de cães em CPI, por diferentes composições do meio de cultura, a fim de determinar a que promove melhor diferenciação. As células isoladas da gordura peri-uterina, após a terceira passagem, apresentaram características de CTM, como elevada expressão de CD90 e CD29 e baixa expressão de CD45 e CD34, além da capacidade para se diferenciar em adipócitos, condroblastos e osteoblastos. As CTM-TA foram distribuídas em seis grupos, de acordo com os meios de cultura: 1) DMEM/F12 alta glicose sem soro fetal bovino (SFB), ß-mercaptoetanol e nicotinamida; 2) DMEM/F12 alta glicose sem SFB, ß- mercaptoetanol, nicotinamida e exendin-4; 3) DMEM/F12 alta glicose sem SFB, ß-mercaptoetanol, nicotinamida, exendin-4, suplemento B27, aminoácidos não essenciais e L-glutamina; 4) cultivo em duas etapas, sendo a primeira (8 dias), com DMEM/F12 alta glicose sem SFB, ß-mercaptoetanol, nicotinamida e a segunda, (9-16dias), com o mesmo meio, acrescido de exendin-4, suplemento B27, aminoácidos não essenciais, L-glutamina e FGFb; 5) DMEM/F12 alta glicose sem SFB e 6) DMEM/F12 baixa glicose com 10% de SFB (controle negativo). Durante a diferenciação, as células foram observadas e fotografadas aos 3, 6, 10, 13 e 16 dias. Aos 16 dias, as culturas de células foram coradas por hematoxilina-eosina e por dithizone, marcador da insulina. Foi também avaliada, por RT-PCR, a expressão dos transcritos gênicos, expressos em células beta pancreáticas, como PDX-1, BETA 2, MafA e Insulin. Durante o cultivo, as CTM-TA dos grupos 1 ao 5 tornaram-se gradualmente mais arredondas e reunidas em clusters, semelhantes às ilhotas pancreáticas. Tais mudanças ocorreram de forma diferenciada entre os grupos, sendo que no grupo 3, os clusters de células eram aparentemente mais numerosos, e formavam agregados maiores. Mas, pela coloração por dithizone, os grupos 3 e 4 foram semelhantes com relação ao tamanho da área média corada para insulina. No entanto, somente o grupo 4 apresentou número de agregados de insulina e área total de insulina corada, significativamente maior em comparação aos demais grupos. Houve também expressão de PDX-1, BETA2/NEUROD, mafA e Insulin nos grupos estudados. Conclui-se que, por manipulação da composição do meio de cultivo, é possível induzir a diferenciação das CTM-TA caninas em CPI e que no grupo 4, onde o cultivo foi realizado em duas etapas, houve a melhor diferenciação das CTM-TA em CPI.

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Type 1 Diabetes mellitus (DM) is a common disease among men and dogs, which has serious complications and no cure. Available treatments have limitations and do not mimic the physiological control that insulin secretion by pancreatic beta cells exerts on glycaemia. In this context, mesenchymal stem cells (MSC) from different species have been used for differentiation into functional beta cells. Historically, dogs have been used as model for men Type 1 DM studies due to the similarities in the presentation and course of this disease between them. However, in this species, little is known about MSC in vitro differentiation into insulin-producing cells (IPCs). The aim of this study was to differentiate adipose mesenchymal stem cells (ADMSC) into IPCs, by using culture mediums with different compositions, so that the most efficient medium composition is determined. Stem cells isolated from the fat tissue close to the bitch uterus, days after the third passage, presented MSC characteristics such as high expression levels of CD90 and CD29, low expression levels of CD45 and CD34, in addition to the ability to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteocytes. ADMSCs were distributed among six groups, according to the culture mediums: 1) High glucose DMEM/F12 without FCS, ßmercaptoethanol, nicotinamide; 2) High glucose DMEM/F12 without FCS, ßmercaptoethanol, nicotinamide and Exendin-4; 3) High glucose DMEM/F12 without FCS, ß-mercaptoethanol, nicotinamide, Exendin-4, B27 supplement, non essential aminoacids, L-glutamine; 4) 2 stage protocol: stage 1 (8 days) with High glucose DMEM/F12 without FCS, ß- mercaptoethanol, nicotinamide and stage 2 (8 days) with High glucose DMEM/F12 without FCS, ß-mercaptoethanol, nicotinamide, Exendin-4, B27 supplement, non essential aminoacids, L-glutamine and FGFb; 5) High glucose DMEM/F12 without FCS; 6) Low glucose DMEM with 10% FCS (negative control). During differentiation, the cells were observed and photographed at day 3, 6, 10, 13 and 16. At day 16, cells were stained by Hematoxylin-Eosin and Dithizone, an insulin marker. It was also evaluated, by RT-PCR, the expression of transcription factors normally expressed in beta cells, such as PDX-1, BETA 2, MafA and Insulin. Over culture, ADMSCs from groups 1 to 5 gradually became rounder and gathered in clusters, which resembled pancreatic islets. These changes happened in a different way in the groups, so that in group 3 cell clusters were apparently more numerous and gathered in bigger aggregates. However, Dithizone staining showed that groups 3 and 4 were similar in terms of medium area stained for insulin. However, only group 4 had the number of insulin aggregates and the total area of stained insulin significantly bigger than the other groups. The expression of PDX-1, BETA 2, MafA e Insulin was also confirmed in all of the studied groups. We conclude that, by manipulating the composition of the culture medium, it is possible to induce dog ADMSCs into IPCs, and that the group 4, in which a two stage protocol was used, there was the best differentiation of dog ADMSCs into IPCs.

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