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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-221015

Resumo

Leptospiras são bactérias espiroquetas com grande capacidade invasiva, dotadas de estratégias eficientes para disseminação no hospedeiro. Recentemente, nosso grupo demonstrou que leptospiras patogênicas secretam proteases capazes de clivar e inativar moléculas-chave do sistema complemento humano. Neste projeto pretende-se ampliar o leque de investigação de possíveis alvos das proteases secretadas por leptospiras patogênicas. O novo alvo a ser estudado é a catelicidina humana (LL-37), um peptídeo antimicrobiano que possui 37 aminoácidos, cuja proteína precursora é denominada hCAP18, devido à sua massa molecular de 18 kDa. Peptídeos antimicrobianos são moléculas pequenas, solúveis, que desempenham um papel importante na resposta imune inata. Porém, alguns patógenos de importância médica conseguem sobreviver à ação dessas moléculas através de mecanismos de resistência. Dentro deste contexto, este estudo tem como objetivo avaliar a atividade de proteases secretadas por estirpes patogênicas, virulentas ou atenuadas em cultura, bem como por estirpes saprófitas da bactéria Leptospira quanto à capacidade de degradar o peptídeo antimicrobiano LL-37. Os resultados apontam a existência de proteases presentes nos sobrenadantes das estirpes patogênicas capazes de degradar o LL-37 de forma tempo-dependente, fato não observado com os sobrenadantes das estirpes saprófitas. Ensaios subsequentes realizados com inibidores de proteases demonstraram que a atividade proteolítica dos sobrenadantes é impossibilitada com o uso do inibidor 1,10-fenantrolina, sugerindo assim que tais proteases pertençam à classe das metaloproteases. De posse desta informação, avaliamos a atividade de duas metaloproteases recombinantes candidatas, a termolisina (codificada pela LIC13322) e a papalisina, secretadas por estirpes patogênicas de Leptospira. Entretanto, o peptídeo foi resistente à ação proteolítica de ambas, e o envolvimento destas metaloproteases neste processo foi descartado. Além disto, a atividade antibacteriana do LL-37 foi avaliada frente a duas estirpes de Leptospira. Os achados apontaram uma maior resistência da estirpe patogênica à ação peptídeo quando comparado à estirpe saprófita. Nossos dados sugerem que a secreção de proteases por estirpes patogênicas pode integrar o arsenal de virulência dessas espiroquetas, tendo em vista que tais proteases foram capazes de inativar a catelicidina humana nos ensaios realizados. Acredita-se que a caracterização de mecanismos relacionados à patogênese da bactéria Leptospira possam, eventualmente, contribuir para o futuro desenvolvimento de estratégias terapêuticas e/ou preventivas que interferiram no processo de invasão e destruição tecidual observados na leptospirose.

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Leptospires are highly invasive spirochetes equipped with efficient strategies for dissemination in the host. Recently, our group demonstrated that pathogenic leptospires secrete proteases capable of cleaving and inactivating key molecules of the human complement system. This project aims to broaden the scope of investigation of possible targets of proteases secreted by pathogenic leptospires. The new target to be studied is human cathelicidin (LL-37), an antimicrobial peptide that has 37 amino acids, whose precursor protein is called hCAP18, because of its molecular mass of 18 kDa. Antimicrobial peptides are small, soluble molecules that play an important role in the innate immune response. However, some pathogens of medical importance can survive the action of these molecules through mechanisms of resistance. In this context, this study aims to evaluate the activity of proteases secreted by pathogenic, and saprophytic Leptospira strains with regard to their ability to degrade the antimicrobial peptide LL-37. The results obtained so far point to the existence of proteases present in the supernatants of pathogenic strains capable of degrading LL-37 in a time-dependent manner, a fact not observed with the supernatants of the saprophytic strains. Subsequent assays performed with protease inhibitors demonstrated that the proteolytic activity of the supernatants is prevented by the use of the 1,10-phenanthroline inhibitor, thus suggesting that such proteases belong to the class of metalloproteases. Based on this information, we evaluated the activity of two candidate recombinant metalloproteases, thermolysin (encoded by LIC13322) and pappalysin, both secreted by pathogenic Leptospira strains. However, the peptide proved to be resistant to the proteolytic action of both, thus ruling out the involvement of these metalloproteases in this process. In addition, the antibacterial activity of LL-37 was evaluated against two Leptospira strains. Our findings showed a greater resistance of the pathogenic strain to the peptide action when compared to the saprophytic strain. Our data suggest that the secretion of proteases by pathogenic strains can integrate the virulence arsenal of these spirochetes, considering that such proteases were able to inactivate human cathelicidin in the assays performed. It is believed that the characterization of mechanisms related to the pathogenesis of Leptospira may eventually contribute to the future development of therapeutic and / or preventive strategies that may interfere in the process of invasion and tissue destruction observed in leptospirosis.

Biblioteca responsável: BR68.1