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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-221203

Resumo

Resumo: A insulina é um hormônio anabólico capaz de atuar na proteção das células espermáticas para minimizar os insultos da criopreservação, também atua na produção de embriões in vitro (PIV) trazendo benefícios no desenvolvimento embrionário devido ao seu efeito antiapoptótico e mitogênico. Desta forma, o presente trabalho visa avaliar os efeitos da adição de insulina ao meio de criopreservação de sêmen sobre o potencial da PIV de embriões. Para isso, foram utilizados dois ejaculados de seis touros (n=12), sendo que cada ejaculado foi distribuído em dois tratamentos para a criopreservação: Grupo controle (CO): sêmen diluído em meio Triladyl (n=12) e Grupo Insulina (IN): sêmen diluído em meio Triladyl suplementado com insulina (150 µUI/mL, n=12). Duas palhetas de sêmen de cada partida de cada tratamento foram descongeladas, homogeneizadas e submetidas à seleção em gradiente de Percoll®. Os espermatozoides obtidos após Percoll® foram avaliados quanto a motilidade, vigor, integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial mitocondrial e fragmentação de DNA e, após foram utilizados para a fertilização in vitro (FIV) de embriões. Para a PIV foram feitas quatro repetições, sendo aspirados folículos de ovários provenientes de abatedouro comercial e selecionados os complexos cumulus-oócito que apresentavam camadas de células do cumullus compactas e oócito com citoplasma homogêneo. Os oócitos foram submetidos ao processo de maturação in vitro (MIV) (22h/38,5oC/5%CO2) e realizada a FIV logo após a maturação. Os oócitos maturados foram distribuídos em dois grupos, sendo que um grupo recebeu o sêmen CO (n=1587) e o outro o sêmen IN (n= 1580). Após a fertilização os oócitos foram incubados (18h/38,5oC/5%CO2) e os zigotos presumíveis foram transferidos para o cultivo in vitro seguindo a ordem dos tratamentos e incubados por 8 dias (38,5ºC/5%CO2/5%O2/90%N2). A resposta da FIV foi determinada pela taxa de clivagem no terceiro dia do cultivo. No dia 8, avaliou-se o número de blastocisto e a taxa de desenvolvimento em relação aos zigotos presumíveis. Os dados foram submetidos à análise de variância pelo procedimento misto (PROC MIXED) do programa SAS versão 9.3. Em todas as análises estatísticas, o nível de significância considerado foi de P0,05. A taxa de clivagem não foi afetada pela adição de insulina ao diluidor de criopreservação do sêmen (64,21±2,04 x 63,62±1,69%), mas foi notada que a insulina causou redução nas taxas de blastocisto (CO: 24,06±2,69% x IN: 20,04±2,54%) e de desenvolvimento embrionário (CO: 35,81±3,23% x IN: 30,21±3,37%). Por outro lado, foram encontrados efeitos de touro para as taxas de clivagem (variando de 54,19±2,34 a 71,91±2,39%), de blastocisto (variando de 6,76±0,97 a 36,18±2,22%) e de desenvolvimento embrionário (variando de 12,32±1,53 a 50,12±2,04%), mas estas alterações não foram relacionadas com variações na qualidade espermática. Em conclusão, a insulina não apresenta efeito benéfico sobre as taxas de produção de embriões in vitro.

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Abstract: Insulin is an anabolic hormone capable of acting in the protection of sperm cells to minimize cryopreservation insults, also acts in the production of in vitro embryos (PIV) bringing benefits in embryonic development due to its effect antiapoptotic and mitogenic. Thus, the present study aims to evaluate the effects of insulin addition to the means of cryopreservation of semen on the potential of PIV of embryos. For this, two ejaculates of six bulls (n=12) were used, each ejaculate was distributed in two treatments for cryopreservation: Control group (CO): semen diluted in Triladyl medium (n = 12) and Insulin Group (IN): semen diluted in Triladyl medium supplemented with insulin (150 µIU / mL, n = 12).Two semen reeds from each match of each treatment were thawed, homogenized and submitted to percoll gradient selection®. Sperm obtained after Percoll® were evaluated for motility, vigor, (acridine orange), plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial potential and DNA fragmentation, and after they were used for in vitro fertilization (IVF) of embryos. For PIV, four replications were performed, and ovaries follicles from commercial slaughterhouse were aspirated and the cumulative-oocyte complexes that presented layers of compact and oocyte cumullus cells with homogeneous cytoplasm were selected The oocytes were submitted to the maturation process in vitro (IVM) (22h/38.5oC/5%CO2) and IVF performed shortly after maturation. Matured oocytes were distributed into two groups, one group received semen CO (n=1587) and the other semen IN (n= 1580). After fertilization the oocytes were incubated (18h/38.5oC/5%CO2) and the presumed zygotes were transferred to in vitro cultivation following the order of treatments and incubated for 8 days (38.5ºC/5%CO2/5%O2/90%N2). The IVF response was determined by the cleavage rate on the third day of cultivation. On day 8, the number of blastocyst and the development rate were evaluated in relation to presumed zygotes. The data were submitted to variance analysis by the mixed procedure (PROC MIXED) of the SAS version 9.3 program. In all statistical analyses, the significance level considered was P0.05. Cleavage rate was not affected by the addition of insulin to the cryopreservation dilution of semen (64.21±2.04 x 63.62±1.69%), but insulin was noted to have caused a reduction in blastocyst rates (CO: 24.06±2.69% x IN: 20.04±2.54%) and embryonic development (CO: 35.81±3.23% x IN: 30.21±3.37%). On the other hand, bull effects were found for cleavage rates (ranging from 54.19±2.34 to 71.91±2.39%), blastocyst (ranging from 6.76±0.97 to 36.18±2.22%) and embryonic development (ranging from 12.32±1.53 to 50.12±2.04%), but these changes were not related to variations in sperm quality. In conclusion, insulin has no beneficial effect on embryo production rates in vitro.

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