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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-222318

Resumo

Os estudos com a tecnologia ômica auxiliam a investigar o papel da sinalização proteica na maturação espermática, capacitação e fertilização. Apesar da importância de estudos sobre moléculas envolvidas na fertilidade, até o momento, na espécie canina, a proteômica do tecido reprodutor não foi descrita. Dessa forma, o objetivo desse estudo e a imunolocalização da osteopontina em testículo, cabeça, corpo e cauda do epidídimo (Artigo I) e descrever o proteoma destes tecidos (Artigo II). A escolha desta proteína foi devida a importância relacionada a fertilidade já demonstrada em outras espécies. Para realização do artigo I, foram colhidos de 3 cães adultos jovens entre 2 a 5 anos, testículos e epidídimos (cabeça, corpo e cauda), sem raça definida, após a orquiectomia eletiva, totalizando 24 amostras. Para realização do artigo II, testículos e epidídimos (cabeça, corpo e cauda) foram colhidos de 3 cães, adultos jovens entre 2 a 5 anos, amostras armazenadas em formalina tamponada durante 48 horas e transferidas para álcool 70%, as amostras passaram por desidratação e reidratação. Foi utilizado anticorpo anti-OPN, as amostras foram coradas com DAB. Todos os tecidos foram marcados com anticorpo, em células próximas a parte luminal do epidídimo e citoplasma, sem diferença significativa (P>0,05). As amostras foram marcadas em célula próximas a parte luminal do epidídimo e citoplasma. Apesar da imunomarcação da OPN no citoplasma das células, em todos os tecidos, esta proteína não foi identificada na abordagem shotgun. Também não houve diferença na imunomarcação da OPN entre os tecidos. No artigo II, foram encontradas 1.918 proteínas, sendo 132 utilizadas na análise multivariada, a qual incluiu a principal component analysis (PCA), variable importance in projection (VIP score) determinada pela partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), ANOVA, dendrograma e diagrama de Venn. Na PCA foram formados 4 clusters distintos, com proximidade dos clusters das amostras da cabeça e corpo do epidídimo. O VIP score indicou 20 proteínas ( > 1,5) e 18 foram confirmadas pelo ANOVA como mais relevantes nos clusters. Seis proteínas foram mais abundantes no corpo, 4 na cabeça do epidídimo e 10 no testículo. As proteínas inositol-3-phosphate synthase 1, equilibrative nucleoside transporter 1, tubulin alpha chain, heat shock protein 90 alpha family class A member 1, heat shock protein family A member 8, heat shock protein family A (HSP70) member 2 e cytochrome P450 family 17 subfamily A member 1, tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta foram mais abundantes no testículo e reduziram gradativamente em direção a cauda do epidídimo. Concluímos que a abundância das proteínas nos tecidos do trato reprodutor está relacionada com a função dos compartimentos de cada compartimento, como o testículo, cabeça, corpo e cauda do epidídimo de cão pode possuir alguma proteína similiar a OPN que se ligue ao anticorpo, porém é necessários maiores investigações.

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Studies with omic technology help to investigate the role of protein signaling in sperm maturation, capacitation and fertilization. Thus, the objective of this study is the immunolocation of osteopontin in the testis, head, body and cauda of the epididymis (Article I) and to describe the proteome of these tissues (Article II). The choice of this protein was due to the importance related to fertility already demonstrated in other species. Article I, 3 young adult dogs aged 2 to 5 years, testicles and epididymis (caput, corpus and cauda), of mixed breed, were collected after elective orchiectomy, totaling 24 samples. For the realization of article II, testicles and epididymis (caput, corpus and tail) were collected from 3 dogs, young adults aged 2 to 5 years, samples stored in buffered formalin for 48 hours and transferred to 70% alcohol, the samples were dehydrated and rehydration. Anti-OPN antibody was used, the samples were stained with DAB. All tissues were labeled with antibody in cells close to the luminal part of the epididymis and cytoplasm, with no significant difference (P> 0.05). Despite the immunostaining of OPN in the cytoplasm of cells, in all tissues, this protein was not identified in the shotgun approach. There was also no difference in the immunostaining of OPN between tissues. In article II, 1,918 proteins were found, 132 of which were used in multivariate analysis, which included the main component analysis (PCA), variable importance in projection (VIP score) determined by the partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), ANOVA , dendrogram and Venn diagram. In the PCA, 4 distinct clusters were formed, with proximity to the clusters of the head and body samples of the epididymis. The VIP score indicated 20 proteins (> 1.5) and 18 were confirmed by ANOVA as the most relevant in the clusters. Six proteins were more abundant in the body, 4 in the epididymis head and 10 in the testis. Inositol-3-phosphate synthase 1, equilibrative nucleoside transporter 1, tubulin alpha chain, heat shock protein 90 alpha family class A member 1, heat shock protein family A member 8, heat shock protein family A (HSP70) member 2 and cytochrome P450 family 17 subfamily A member 1, tyrosine 3-monooxygenase / tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta were more abundant in the testis and gradually reduced towards the tail of the epididymis. We conclude that the abundance of proteins in the tissues of the reproductive tract is related to the function of the compartments of each compartment, as the testis, caput, corpus and cauda of the dog epididymis may have some protein similar to OPN that binds to the antibody, however it is urther investigation is needed.

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