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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-7113

Resumo

O desenvolvimento deste trabalho foi dividido em dois estudos. Inicialmente foi construído um baculovírus recombinante, expressando a glicoproteína E (gE) do Herpesvírus Bovino tipo 1 (BHV-1), com o objetivo de desenvolver um teste de ELISA específico para a detecção de anticorpos anti-gE, capaz de diferenciar os animais infectados de animais imunizados com vacinas diferenciais (gE-deletadas). O gene gE foi amplificado por PCR a partir da amostra EVI 123 (BHV-1.1), e sua seqüência comparada com a amostra padrão de BHV-1 Cooper. Para a inserção do gene gE EVI 123 no vírus da Poliedrose Nuclear da Autografa californica (AcNPV) foi utilizado o sistema de transposição e multiplicação Bac-to-Bac®, originando o recombinante denominado recBAC-gE-123. O recombinante foi multiplicado em sistema eucariótico de células de inseto Sf-9, sendo avaliado sua capacidade de expressão e as propriedades antigênicas da proteína recombinante gE. A proteína gE expressa pelo recombinante recBAC-gE-123 foi avaliada na imunização de camundongos BALB/c para a produção de anticorpos monoclonais, e na utilização como antígeno em testes de ELISA, indireto e de bloqueio, utilizando 45 soros positivos e 45 soros negativos para anticorpos contra o BHV-1, e soros de 45 animais imunizados com a vacina BHV-1 265gE-deletada. Os resultados mostraram que o uso da vacina gE-deletada associada ao teste de ELISA-gE, a partir do recombinante recBAC-gE-123, permitiram a diferenciação entre animais vacinados e infectados. Com a finalidade de iniciar estudos que avaliam a importância de glicoproteínas essenciais no processo neuroinvasivo e neurovirulência do Herpesvírus Bovino tipo 5 (BHV-5), tais como a glicoproteína B (gB), foi construído um vetor de deleção para gerar um mutante BHV-5 gB-deletada. A construção do vetor foi baseada em sistemas de pareamento homólogo e transposição mediada por sítios LoxP, como também a utilização de genes repórter e de seleção para o isolamento do mutante e sua posterior multiplicação como cromossoma bacteriano artificial (BAC). Neste trabalho pode ser avaliado a construção de extensos vetores (15 Kb), com a inserção de múltiplos genes utilizados pelo sistema BAC, assim como diferentes métodos de co-transfecções com o vetor de deleção pBAC-gB5-del e o DNA viral. Além disso, para o isolamento do mutante gB-deletada foi necessária a utilização de cultivos celulares expressando gB para a complementação fenotípica do mutante. Os resultados obtidos, embora ainda necessitem de confirmação, sugerem a possibilidade de que a gB do BHV-1 não seria capaz de complementar fenotipicamente mutantes BHV-5 gB-deletada

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