B1 lymphocytes develop independently of Notch signaling during mouse embryonic development.

B1 lymphocytes are a small but unique component of the innate immune-like cells. However, their ontogenic origin is still a matter of debate. Although it is widely accepted that B1 cells originate early in fetal life, whether or not they arise from hematopoietic stem cells (HSCs) is still unclear. In order to shed light on the B1 cell origin, we set out to determine whether their lineage specification is dependent on Notch signaling, which is essential for the HSC generation and, therefore, all derivatives lineages. Using mouse embryonic stem cells (mESCs) to recapitulate murine embryonic development, we have studied the requirement for Notch signaling during the earliest B-cell lymphopoiesis and found that Rbpj-deficient mESCs are able to generate B1 cells. Their Notch independence was confirmed in ex vivo experiments using Rbpj-deficient embryos. In addition, we found that upregulation of Notch signaling induced the emergence of B2 lymphoid cells. Taken together, these findings indicate that control of Notch signaling dose is crucial for different B-cell lineage specification from endothelial cells and provides pivotal information for their in vitro generation from PSCs for therapeutic applications. This article has an associated 'The people behind the papers' interview.

The Transcription Factor NFIL3 Is Essential for Normal Placental and Embryonic Development but Not for Uterine Natural Killer (UNK) Cell Differentiation in Mice.

Mice ablated for the gene encoding the transcription factor Nfil3 lack peripheral natural killer (NK) cells but retain tissue-resident NK cells, particularly in mucosal sites, including virgin uterus. We undertook a time course histological study of implantation sites from syngeneically (Nfil3(-/-)) and allogeneically (BALB/c) mated Nfil3(-/-) females. We also examined implantation sites from Rag2(-/-)Il2rg(-/-) females preconditioned by adoptive transfer of Nfil3(-/-) marrow or uterine cell suspensions to identify the Nfil3(-/-) pregnancy aberrations that could be attributed to nonlymphoid cells. Uterine NKs (UNKs) reactive and nonreactive with the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) differentiate, localize, and mature within Nfil3(-/-) implantation sites, although at reduced abundance. The DBA nonreactive UNK cells were enriched following Nfil3(-/-) marrow transplantation. Uterine lumen closure, early embryonic development, and differentiation of antimesometrial decidua were delayed in Nfil3(-/-) implantation sites. Major disturbances to the decidual-trophoblast interface that did not lead to fetal death were attributed to NFIL3 deficiency in trophoblast. At midgestation, vessels of the placental labyrinth were enlarged, suggestive of reduced branching morphogenesis. A major term complication in most Nfil3(-/-) × Nfil3(-/-) pregnancies but not Nfil3(-/-) × Nfil3(+/-) pregnancies was dystocia. These studies highlight the differentiation potential and functions of Nfil3(-/-) UNK cell progenitors and illustrate that much of the implantation site histopathology associated with this strain is due to Nfil3 deletion in nonlymphoid cell lineages.

HSC-independent definitive hematopoiesis persists into adult life.

It is widely believed that hematopoiesis after birth is established by hematopoietic stem cells (HSCs) in the bone marrow and that HSC-independent hematopoiesis is limited only to primitive erythro-myeloid cells and tissue-resident innate immune cells arising in the embryo. Here, surprisingly, we find that significant percentages of lymphocytes are not derived from HSCs, even in 1-year-old mice. Instead, multiple waves of hematopoiesis occur from embryonic day 7.5 (E7.5) to E11.5 endothelial cells, which simultaneously produce HSCs and lymphoid progenitors that constitute many layers of adaptive T and B lymphocytes in adult mice. Additionally, HSC lineage tracing reveals that the contribution of fetal liver HSCs to peritoneal B-1a cells is minimal and that the majority of B-1a cells are HSC independent. Our discovery of extensive HSC-independent lymphocytes in adult mice attests to the complex blood developmental dynamics spanning the embryo-to-adult transition and challenges the paradigm of HSCs exclusively underpinning the postnatal immune system.

Engineered models for placental toxicology: Emerging approaches based on tissue decellularization.

Recent increases in prescriptions and illegal drug use as well as exposure to environmental contaminants during pregnancy have highlighted the critical importance of placental toxicology in understanding and identifying risks to both mother and fetus. Although advantageous for basic science, current in vitro models often fail to capture the complexity of placental response, likely due to their inability to recreate and monitor aspects of the microenvironment including physical properties, mechanical forces and stiffness, protein composition, cell-cell interactions, soluble and physicochemical factors, and other exogenous cues. Tissue engineering holds great promise in addressing these challenges and provides an avenue to better understand basic biology, effects of toxic compounds and potential therapeutics. The key to success lies in effectively recreating the microenvironment. One strategy to do this would be to recreate individual components and then combine them. However, this becomes challenging due to variables present according to conditions such as tissue location, age, health status and lifestyle. The extracellular matrix (ECM) is known to influence cellular fate by working as a storage of factors. Decellularized ECM (dECM) is a recent tool that allows usage of the original ECM in a refurbished form, providing a relatively reliable representation of the microenvironment. This review focuses on using dECM in modified forms such as whole organs, scaffold sheets, electrospun nanofibers, hydrogels, 3D printing, and combinations as building blocks to recreate aspects of the microenvironment to address general tissue engineering and toxicology challenges, thus illustrating their potential as tools for future placental toxicology studies.

The DNMT1 inhibitor GSK-3484862 mediates global demethylation in murine embryonic stem cells.

BACKGROUND: DNA methylation plays an important role in regulating gene expression in mammals. The covalent DNMT1 inhibitors 5-azacytidine and decitabine are widely used in research to reduce DNA methylation levels, but they impart severe cytotoxicity which limits their demethylation capability and confounds interpretation of experiments. Recently, a non-covalent inhibitor of DNMT1 called GSK-3484862 was developed by GlaxoSmithKline. We sought to determine whether GSK-3484862 can induce demethylation more effectively than 5-azanucleosides. Murine embryonic stem cells (mESCs) are an ideal cell type in which to conduct such experiments, as they have a high degree of DNA methylation but tolerate dramatic methylation loss. RESULTS: We determined the cytotoxicity and optimal concentration of GSK-3484862 by treating wild-type (WT) or Dnmt1/3a/3b triple knockout (TKO) mESC with different concentrations of the compound, which was obtained from two commercial sources. Concentrations of 10 µM or below were readily tolerated for 14 days of culture. Known DNA methylation targets such as germline genes and GLN-family transposons were upregulated within 2 days of the start of GSK-3484862 treatment. By contrast, 5-azacytidine and decitabine induced weaker upregulation of methylated genes and extensive cell death. Whole-genome bisulfite sequencing showed that treatment with GSK-3484862 induced dramatic DNA methylation loss, with global CpG methylation levels falling from near 70% in WT mESC to less than 18% after 6 days of treatment with GSK-3484862. The treated cells showed a methylation level and pattern similar to that observed in Dnmt1-deficient mESCs. CONCLUSIONS: GSK-3484862 mediates striking demethylation in mESCs with minimal non-specific toxicity.

What do the lineage tracing studies tell us? Consideration for hematopoietic stem cell origin, dynamics, and leukemia-initiating cells.

The recent advance of technologies enables us to trace the cell fate in vivo by marking the cells that express the gene of interest or by barcoding them at a single cell level. Various tamoxifen-inducible Cre-recombinase mice combined with Rosa-floxed lines are utilized. In this review, with the results revealed by lineage tracing assays, we re-visit the long-standing debate for the origin of hematopoietic stem cells in the mouse embryo, and introduce the view of native hematopoiesis, and possible leukemic-initiating cells emerged during fetal stages.

Long-Term Engraftment of ESC-Derived B-1 Progenitor Cells Supports HSC-Independent Lymphopoiesis.

It is generally considered that mouse embryonic stem cell (ESC) differentiation into blood cells in vitro recapitulates yolk sac (YS) hematopoiesis. As such, similar to YS-derived B-progenitors, we demonstrate here that ESC-derived B-progenitors differentiate into B-1 and marginal zone B cells, but not B-2 cells in immunodeficient mice after transplantation. ESC-derived B-1 cells were maintained in the recipients for more than 6 months, secreting natural IgM antibodies in vivo. Gene expression profiling displayed a close relationship between ESC- and YS-derived B-1 progenitors. Because there are no hematopoietic stem cells (HSCs) detectable in our ESC differentiation culture, successful long-term engraftment of ESC-derived functional B-1 cells supports the presence of HSC-independent B-1 cell development.

Hemogenic Endothelial Cells Can Transition to Hematopoietic Stem Cells through a B-1 Lymphocyte-Biased State during Maturation in the Mouse Embryo.

Precursors of hematopoietic stem cells (pre-HSCs) have been identified as intermediate precursors during the maturation process from hemogenic endothelial cells to HSCs in the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region of the mouse embryo at embryonic day 10.5. Although pre-HSCs acquire an efficient adult-repopulating ability after ex vivo co-culture, their native hematopoietic capacity remains unknown. Here, we employed direct transplantation assays of CD45-VE-cadherin(VC)+KIT+(V+K+) cells (containing pre-HSCs) into immunodeficient neonatal mice that permit engraftment of embryonic hematopoietic precursors. We found that freshly isolated V+K+ cells exhibited significantly greater B-1 lymphocyte-biased repopulating capacity than multilineage repopulating capacity. Additionally, B cell colony-forming assays demonstrated the predominant B-1 progenitor colony-forming ability of these cells; however, increased B-2 progenitor colony-forming ability emerged after co-culture with Akt-expressing AGM endothelial cells, conditions that support pre-HSC maturation into HSCs. Our studies revealed an unexpected B-1 lymphocyte bias of the V+K+ population and acquisition of B-2 potential during commitment to the HSC fate.

Mechanism of hematopoiesis and vasculogenesis in mouse placenta.

The placenta plays a major role in the development of blood cells in the mouse and human embryo. Hematopoiesis and vasculogenesis in placenta are two closely interconnected processes. The mouse model has been widely used to study placental hematopoiesis. During mid-gestation, mouse placenta generate blood cells and support the proliferation, maturation and erythroid differentiation of hematopoietic cells within two major vascular niches in the labyrinth. Here, we review the vasculogenesis in chorioallantoic mouse placenta and the current knowledge on hematopoietic activity, niche and origin in mice placenta.

Brazilian Guidelines for Hereditary Angioedema Management - 2017 Update Part 1: Definition, Classification and Diagnosis.

Hereditary angioedema is an autosomal dominant disease characterized by recurrent angioedema attacks with the involvement of multiple organs. The disease is unknown to many health professionals and is therefore underdiagnosed. Patients who are not adequately diagnosed and treated have an estimated mortality rate ranging from 25% to 40% due to asphyxiation by laryngeal angioedema. Intestinal angioedema is another important and incapacitating presentation that may be the main or only manifestation during an attack. In this article, a group of experts from the "Associação Brasileira de Alergia e Imunologia (ASBAI)" and the "Grupo de Estudos Brasileiro em Angioedema Hereditário (GEBRAEH)" has updated the Brazilian guidelines for the diagnosis and treatment of hereditary angioedema.

Localization of transient immature hematopoietic cells to two distinct, potential niches in the developing mouse placenta.

Previous studies have shown that human and mouse placentas have hematopoietic potential during mid-gestation. In this investigation, we used histological and immunohistological approaches to visualize hematopoietic cells in mouse placenta between 9.5 and 12.5 days of gestation (gd), identifying their topography and niche. Putative hematopoietic foci were present on 10.5 and 11.5 gd but not 9.5 or 12.5 gd and was restricted to the placental labyrinth. Two major niches each with distinctive hematopoietic cell clusters were present. One type of hematopoietic cell cluster involved the chorioallantoic vasculature and fetal vessels near the chorionic plate. These clusters resembled the hematopoietic stem cells produced by large embryonic arteries such as aorta that persist in postnatal marrow. The other type of hematopoietic cell cluster identified was at the opposite side of labyrinth next to the junctional zone and was composed of erythropoietic foci. Our results suggest that mouse placenta not only produces hematopoietic stem/progenitor cells but also a second wave of primitive erythrocytes that may support a rapid, mid-pregnancy, fetal growth trajectory. Our data also point to a close relationships in the origins of hematopoietic and endothelial cells within placenta.

Brazilian Guidelines for Hereditary Angioedema Management - 2017 Update Part 1: Definition, Classification and Diagnosis

Hereditary angioedema is an autosomal dominant disease characterized by recurrent angioedema attacks with the involvement of multiple organs. The disease is unknown to many health professionals and is therefore underdiagnosed. Patients who are not adequately diagnosed and treated have an estimated mortality rate ranging from 25% to 40% due to asphyxiation by laryngeal angioedema. Intestinal angioedema is another important and incapacitating presentation that may be the main or only manifestation during an attack. In this article, a group of experts from the "Associação Brasileira de Alergia e Imunologia (ASBAI)" and the "Grupo de Estudos Brasileiro em Angioedema Hereditário (GEBRAEH)" has updated the Brazilian guidelines for the diagnosis and treatment of hereditary angioedema.

Diretrizes brasileiras para o diagnóstico e tratamento do angioedema hereditário ­ 2017 / Brazilian guidelines for the diagnosis and treatment of hereditary angioedema ­ 2017

O angioedema hereditário é uma doença autossômica dominante caracterizada por crises de edema com o envolvimento de múltiplos órgãos. A doença é desconhecida por muitos profissionais da área da saúde e, portanto, subdiagnosticada. Os pacientes que não são diagnosticados e tratados adequadamente têm uma mortalidade estimada de 25% a 40%, devido ao angioedema da laringe, resultando em asfixia. O angioedema de alças intestinais é outra manifestação importante e incapacitante, que pode ser a principal ou a única durante uma crise da doença. Neste cenário, um grupo de especialistas da Associação Brasileira de Alergia e Imunologia (ASBAI) e do Grupo de Estudos Brasileiro em Angioedema Hereditário (GEBRAEH) atualizou as diretrizes para o diagnóstico e terapia do angioedema hereditário.

Hereditary angioedema is an autosomal dominant disease characterized by edema attacks with the involvement of multiple organs. The disease is unknown to many health professionals and is therefore underdiagnosed. Patients who are not adequately diagnosed and treated have an estimated mortality rate ranging from 25% to 40%, due to laryngeal angioedema, which results in asphyxia. Angioedema affecting bowel loops is another important, incapacitating presentation that may be the main or only manifestation during a crisis. In this scenario, a group of experts affiliated with Associação Brasileira de Alergia e Imunologia (ASBAI) and Grupo de Estudos Brasileiro em Angioedema Hereditário (GEBRAEH) has updated the guidelines for the diagnosis and treatment of hereditary angioedema.

O Papel da Placenta na Ontogenia do Sistema HematopoéticoOrigem, Distribuição Espacial e Perfil Fenotípico e de Expressão Gênica de Células Comprometidas com a Hematopoese$

Apesar de alguns estudos terem identificado um potencial hematopoético da placenta humana e de camundongos, pouco se sabe sobre a real contribuição deste tecido na ontogenia do sistema sanguíneo e da vasculogênese. Nesse sentido, o grande impacto potencial dessa constatação contrasta com a escassez de artigos que falam sobre a hematopoese na placenta. Propusemo-nos então a realizar um estudo detalhado das células hematopoéticas da placenta de camundongos durante a metade da gestação identificando a sua topografia e nicho. O objetivo foi identificar prováveis arranjos hematopoéticos e vasculares bem como a identidade dos precursores e das células que compõem o microambiente indutor. Para isso, foram realizadas análises morfológicas da placenta de camundongos na metade da gestação através de técnicas de histologia convencional, imunofluorescência de tecidos e de whole mount. Foram analisados camundongos de diferentes linhagens incluindo Swiss Webster, C57BL/6 e camundongos knockout para o gene Pgf (Pgf-/-). Foram realizadas também análises da expressão gênica de células após sua captura por microdissecção a laser e experimentos de enxerto subcapsular renal. Nestes, o cone ectoplacentário (EPC) de camundongos que expressavam GFP foi implantado abaixo da cápsula renal de camundongos receptores imunodeficientes. Foram identificados dois nichos principais na região de labirinto das placentas com 10,5 e 11,5 dias gestacionais, nos quais as células sanguíneas parecem se diferenciar por mecanismos distintos que ocorrem no mesmo período do desenvolvimento Além de formar células tronco e progenitores hematopoéticos de forma distinta, a porção distal da placenta parece também induzir a proliferação destas células e ainda uma segunda onda de eritrócitos nucleados que atende ao rápido crescimento fetal dessa etapa da gestação. Algumas células trofoblásticas gigantes, células espongiotrofoblásticas e deciduais podem fornecer um nicho favorável à eritropoese. Foi observado uma forte associação entre as células hematopoéticas e endoteliais sugerindo uma origem comum a essas duas linhagens celulares. A imunofluorescência mostrou a transição epitélio-mesenquimal de algumas células espongiotrofoblásticas. O potencial intrínseco de transição epitélio-mesenquimal destas células bem como seu potencial de diferenciação em células hematopoéticas Runx1+ foi confirmado em experimentos de enxerto com o EPC, o tecido progenitor das células espongiotrofoblásticas. A análise dos camundongos Pgf-/- reforçaram a teoria de que as linhagens hematopoéticas e endoteliais podem ser formadas de novo a partir de endotélio hemogênico. A análise da expressão gênica de células hematopoéticas microdissecadas não só ajudou na caracterização destas células na placenta como também confirmaram que algumas células espongiotrofoblásticas poderiam formar células sanguíneas por um mecanismo de diferenciação epitélio-mesenquimal-hematopoético

Estudo histológico da placenta murina com enfoque em seu potencial hematopoético / Histological study of murine placenta with a focus on their potential hematopoietic

As células-tronco hematopoéticas (CTH), encontradas na medula óssea de mamíferos adultos, são formadas durante a embriogênese, em múltiplos locais anatômicos, migrando de um sítio para outro onde são expandidas e diferenciadas até seu estabelecimento definitivo na medula óssea. Recentemente, estudos in vitro têm demonstrado que a placenta possui potencial hematopoético, revelando a presença de progenitores multipotentes e autorrenováveis. Não obstante a importância destes trabalhos, a maioria empregou métodos in vitro, o que não significa que in vivo este potencial se expresse em algum momento. No entanto, há dados que mostraram focos de eritropoese placentária observadas em 10,5 dias-pós-coito (dpc) formando maciços celulares no labirinto que, depois, se configuravam no interior de vasos. Dentro desse cenário, nos propusemos a aprofundar essa questão a partir de um maior detalhamento morfológico in situ de placentas de camundongo em diferentes idades gestacionais, avaliando a efetiva participação da placenta na hematopoese. Para tal, foi feita uma análise histológica da placenta de camundongos Swiss Webster entre 9,5 e 11,5 dpc, através de cortes seriados e da utilização de colorações convencionais e específicas, bem como empregando marcações com anticorpos ou por lectinas conjugadas a FITC

Foi dada ênfase às células sanguíneas encontradas neste período, procurando por possíveis focos de atividade hematopoética, ao mesmo tempo em que se fez necessário uma caracterização morfológica deste órgão, cuja literatura em camundongos é escassa. Células maiores e mais globosas que as células eritróides imaturas oriundas do saco vitelínico foram observadas circulando nos vasos sanguíneos fetais da placenta, sendo que em algumas áreas, tais células não pareciam estar envolvidas por endotélio e pareciam estar aderidas umas às outras. Numerosos brotamentos de células imaturas de morfologia trofoblástica foram observados, exibindo adesões largas ou sob a forma de pedículos de adesão com endotélio e/ou trofoblasto adjacente, com algumas células hemoglobinizadas. Ainda, em algumas áreas, foram observados conjuntos de células eritróides de aspecto trofoblástico formando aglomerados diferenciais em meio à massa trofoblástica, com células aderidas e com diferentes graus de hemoglobinização. Esses achados encontravam-se principalmente à região de labirinto próxima às células trofoblásticas gigantes e espongiotrofoblasto

Aglomerados hematopoéticos semelhantes aos brotamentos de CTH da região de aorta-gônadas-mesonefros (AGM) e vasos umbilicais e vitelínicos também foram encontrados próximos à face fetal da placenta. A imunomarcação revelou a presença de eritropoietina na decídua, a qual pode ter então papel importante na indução da eritropoese encontrada, bem como de fator de von Willebrand em células que se projetavam para dentro da circulação fetal. Ainda, células de aspecto trofoblástico no interior dos vasos fetais foram Sca-1 positivas. A utilização de lectinas permitiu caracterizar, ao menos parcialmente, os resíduos de açúcar presentes nos diferentes endotélios e na barreira materno-fetal. Em conclusão, os resultados do presente estudo trazem contribuições originais ao estudo morfológico da placenta na metade da gestação, contribuindo para a compreensão da participação da placenta na ontogenia do sistema hematopoético em mamíferos (AU)

Estudo histológico da placenta murina com enfoque em seu potencial hematopoético / Histological study of murine placenta with a focus on their potential hematopoietic

As células-tronco hematopoéticas (CTH), encontradas na medula óssea de mamíferos adultos, são formadas durante a embriogênese, em múltiplos locais anatômicos, migrando de um sítio para outro onde são expandidas e diferenciadas até seu estabelecimento definitivo na medula óssea. Recentemente, estudos in vitro têm demonstrado que a placenta possui potencial hematopoético, revelando a presença de progenitores multipotentes e autorrenováveis. Não obstante a importância destes trabalhos, a maioria empregou métodos in vitro, o que não significa que in vivo este potencial se expresse em algum momento. No entanto, há dados que mostraram focos de eritropoese placentária observadas em 10,5 dias-pós-coito (dpc) formando maciços celulares no labirinto que, depois, se configuravam no interior de vasos. Dentro desse cenário, nos propusemos a aprofundar essa questão a partir de um maior detalhamento morfológico in situ de placentas de camundongo em diferentes idades gestacionais, avaliando a efetiva participação da placenta na hematopoese. Para tal, foi feita uma análise histológica da placenta de camundongos Swiss Webster entre 9,5 e 11,5 dpc, através de cortes seriados e da utilização de colorações convencionais e específicas, bem como empregando marcações com anticorpos ou por lectinas conjugadas a FITC. Foi dada ênfase às células sanguíneas encontradas neste período, procurando por possíveis focos de atividade hematopoética, ao mesmo tempo em que se fez necessário uma caracterização morfológica deste órgão, cuja literatura em camundongos é escassa. Células maiores e mais globosas que as células eritróides imaturas oriundas do saco vitelínico foram observadas circulando nos vasos sanguíneos fetais da placenta, sendo que em algumas áreas, tais células não pareciam estar envolvidas por endotélio e pareciam estar aderidas umas às outras. Numerosos brotamentos de células imaturas de morfologia trofoblástica foram observados, exibindo adesões largas ou sob a forma de pedículos de adesão com endotélio e/ou trofoblasto adjacente, com algumas células hemoglobinizadas. Ainda, em algumas áreas, foram observados conjuntos de células eritróides de aspecto trofoblástico formando aglomerados diferenciais em meio à massa trofoblástica, com células aderidas e com diferentes graus de hemoglobinização. Esses achados encontravam-se principalmente à região de labirinto próxima às células trofoblásticas gigantes e espongiotrofoblasto. Aglomerados hematopoéticos semelhantes aos brotamentos de CTH da região de aorta-gônadas-mesonefros (AGM) e vasos umbilicais e vitelínicos também foram encontrados próximos à face fetal da placenta. A imunomarcação revelou a presença de eritropoietina na decídua, a qual pode ter então papel importante na indução da eritropoese encontrada, bem como de fator de von Willebrand em células que se projetavam para dentro da circulação fetal. Ainda, células de aspecto trofoblástico no interior dos vasos fetais foram Sca-1 positivas. A utilização de lectinas permitiu caracterizar, ao menos parcialmente, os resíduos de açúcar presentes nos diferentes endotélios e na barreira materno-fetal. Em conclusão, os resultados do presente estudo trazem contribuições originais ao estudo morfológico da placenta na metade da gestação, contribuindo para a compreensão da participação da placenta na ontogenia do sistema hematopoético em mamíferos.