Bioassay-Guided Fractionation of Siparuna glycycarpa n-Butanol Extract with Inhibitory Activity against Influenza A(H1N1)pdm09 Virus by Centrifugal Partition Chromatography (CPC).

Siparuna glycycarpa occurs in the Amazon region, and some species of this genus are used in Brazilian folk medicine. A recent study showed the inhibitory effect of this species against influenza A(H1N1)pdm09 virus, and in order to acquire active fractions, a polar solvent system n-butanol-methanol-water (9:1:10, v/v) was selected and used for bioassay-guided fractionation of n-butanol extract by centrifugal partition chromatography (CPC). The upper phase was used as stationary phase and the lower phase as mobile (descending mode). Among the collected fractions, the ones coded SGA, SGC, SGD, and SGO showed the highest antiviral inhibition levels (above 74%) at 100 µg·mL-1 after 24 h of infection. The bioactive fractions chemical profiles were investigated by LC-HRMS/MS data in positive and negative ionization modes exploring the Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) platform to build a molecular network. Benzylisoquinoline alkaloids were annotated in the fractions coded SGA, SGC, and SGD collected during elution step. Aporphine alkaloids, O-glycosylated flavonoids, and dihydrochalcones in SGO were acquired with the change of mobile phase from lower aqueous to upper organic. Benzylisoquinolinic and aporphine alkaloids as well as glycosylated flavonoids were annotated in the most bioactive fractions suggesting this group of compounds as responsible for antiviral activity.

Estudo in vitro e in vivo da ação de novas drogas sobre a replicação do vírus influenza

Os vírus influenza são um dos principais causadores das infecções respiratórias agudas e apresentam grande impacto na saúde pública. Existe somente uma classe de drogas antiinfluenza em uso atualmente, os inibidores de neuraminidase, como o oseltamivir. Como já foram descritas cepas circulantes resistentes a este composto, torna-se necessária a busca por novas moléculas capazes de inibir essas cepas e/ou atuar sobre outros alvos durante a replicação viral. Este trabalho visa estudar o mecanismo de ação de quatro novos compostos contra o vírus influenza: aureonitol, composto 1i, tritempo e composto 5b. Todos os compostos inibiram a replicação do vírus influenza em células MDCK com baixa toxicidade e apresentaram alto índice de seletividade para utilização in vitro. O aureonitol, um produto natural derivado de espécies do fungo Chaetomium, é um potente inibidor da hemaglutinina do vírus influenza, bloqueando a entrada do vírus na célula hospedeira. O composto 1i é um composto oxoquinolínico capaz de inibir a neuraminidase do vírus influenza. Embora seja menos potente que o oseltamivir em inibir cepas sensíveis, nosso composto foi capaz de inibir cepas resistentes nas quais o oseltamivir não possui efeito inibitório O tritempo possui uma estrutura química semelhante ao 1i e se mostrou ainda mais potente em inibir a neuraminidase viral de cepas sensíveis e resistentes ao oseltamivir além de não apresentar resistência cruzada com o composto de referência. O composto 5b é um análogo da ribavirina e tem como alvo a RNA polimerase do influenza, desregulando o balanço entre os processos de duplicação e transcrição do genoma viral. Este também possui propriedades imunomoduladoras in vitro e em camundongos infectados pelo vírus influenza. Os quatro compostos se mostraram potentes inibidores do vírus influenza, com mecanismos de ação inovadores, tornando suas estruturas químicas promissoras para o desenvolvimento de novas drogas anti-influenza. Estudamos também a atividade natural endógena da RNA polimerase do vírus influenza e descrevemos suas aplicações para melhorar a sensibilidade do diagnóstico e como ferramenta para triagem de novas drogas com alvo na RNA polimerase viral.

Efeitos do análogo triazólico da Ribavirina, PAR038, sobre a replicação in vitro do vírus influenza / Effects of a ribavirin triazolic analogue, PAR038, in the in vitro replication of influenza virus

Os vírus influenza representam uma das principais causas das infecções respiratórias agudas, e são de grande impacto para saúde pública devido a ocorrência de epidemias sazonais e pandemias. A variabilidade genética deste vírus e seu amplo espectro de hospedeiros dificulta o controle das infecções através da vacinação, o que torna os antivirais importantes na prevenção e tratamento. Até o presente momento, existem duas classes de antivirais disponíveis para o tratamento da infecção pelo vírus influenza, os bloqueadores de canal M2 (amandadina e rimantadina), que não são mais utilizados clinicamente pois as cepas circulantes são resistentes e os inibidores de neuraminidase (NAIs – oseltamivir e zanamivir), classe em uso clínico embora já tenham sido descritas cepas resistentes ao oseltamivir. Existe também a ribavirina, um antiviral de amplo espectro que inibe DNA/RNA polimerases virais mas é altamente citotóxico. Devido ao número limitado de drogas anti-influenza, vem sendo realizados estudos sobre a eficácia da ribavirina e sua combinação com NAIs para tratamento das infecções causadas pelo influenza. A RNA polimerase do vírus influenza vem sendo cada vez mais explorada como alvo para novas drogas, e, desta forma, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito antiviral do PAR038, um análogo triazólico da ribavirina como potencial inibidor da polimerase. O composto PAR038 se mostrou menos citotóxico para células MDCK e 400 vezes mais potente que a ribavirina, com CC50 > 1000 miM e IC50 = 0,07 miM. Nosso composto foi capaz de inibir a RNA polimerase do vírus influenza com EC50 igual a 1,6 +/- 0.15 miM, além de inibir a replicação viral em células A549 (IC50 = 21,2 miM) e apresentar propriedades imunomodulatórias, já que diminuiu os níveis de IL-8 e MCP-1 no sobrenadante das células A549 infectadas com o vírus influenza...

Influenza virus represents one of the main causes of acute respiratory infections, beinga major cause of mortality, morbidity and burden to public health system. The geneticvariability of influenza viruses and broad spectrum of these viruses` hosts impose difficultiesin control strategies through vaccination. Therefore, antiviral drugs have become critical in theprevention and treatment of the infections caused by influenza viruses. There are two classesof anti-influenza drugs, M2 channel blockers (amantadine and rimantadine), which are nolonger used since circulating strains are resistant to these antivirals, and neuraminidaseinhibitors (NAIs – oseltamivir and zanamivir), in clinical use. Despite that, oseltamivirresistantstrains have been described. An additional antiviral, ribavirin, is endowed with abroad spectrum activity against DNA/RNA polymerases, although high cytotoxic has beendescribed. Due to the limited number of anti-influenza drugs, studies have been carried out onthe effectiveness of ribavirin and its combination with NAIs for treating influenza infections.Thus, influenza RNA polymerase still is a valid target for development of novel antiviral.Based on that, we aimed here to investigate the antiviral effect of PAR038, a triazolicanalogue of ribavirin. PAR038 is 400-fold potent than ribavirin, with CC50 > 1000 µM andIC50 = 0,07 µM towards MDCKs cytotoxicity and influenza in vitro replication. Ourcompound inhibits influenza RNA polymerase with an EC50 of 1,6 ± 0,15 µM and alsoinhibits viral replication in an A549 cells (IC50 = 21,2 µM)...

Efeitos do análogo triazólico da Ribavirina, PAR038, sobre a replicação in vitro do vírus influenza / Effects of a ribavirin triazolic analogue, PAR038, in the in vitro replication of influenza virus

Os vírus influenza representam uma das principais causas das infecções respiratórias agudas, e são de grande impacto para saúde pública devido a ocorrência de epidemias sazonais e pandemias. A variabilidade genética deste vírus e seu amplo espectro de hospedeiros dificulta o controle das infecções através da vacinação, o que torna os antivirais importantes na prevenção e tratamento. Até o presente momento, existem duas classes de antivirais disponíveis para o tratamento da infecção pelo vírus influenza, os bloqueadores de canal M2 (amandadina e rimantadina), que não são mais utilizados clinicamente pois as cepas circulantes são resistentes e os inibidores de neuraminidase (NAIs oseltamivir e zanamivir), classe em uso clínico embora já tenham sido descritas cepas resistentes ao oseltamivir. Existe também a ribavirina, um antiviral de amplo espectro que inibe DNA/RNA polimerases virais mas é altamente citotóxico. Devido ao número limitado de drogas anti-influenza, vem sendo realizados estudos sobre a eficácia da ribavirina e sua combinação com NAIs para tratamento das infecções causadas pelo influenza. A RNA polimerase do vírus influenza vem sendo cada vez mais explorada como alvo para novas drogas, e, desta forma, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito antiviral do PAR038, um análogo triazólico da ribavirina como potencial inibidor da polimerase. O composto PAR038 se mostrou menos citotóxico para células MDCK e 400 vezes mais potente que a ribavirina, com CC50 > 1000 miM e IC50 = 0,07 miM. Nosso composto foi capaz de inibir a RNA polimerase do vírus influenza com EC50 igual a 1,6 +/- 0.15 miM, além de inibir a replicação viral em células A549 (IC50 = 21,2 miM) e apresentar propriedades imunomodulatórias, já que diminuiu os níveis de IL-8 e MCP-1 no sobrenadante das células A549 infectadas com o vírus influenza.

Após 2 passagens do vírus influenza A H3N2 em células MDCK, utilizando-se uma concentração do PAR038 aproximadamente 400 vezes maior que seu IC50, ainda não foram observadas mutações de resistência ao composto. O PAR038 se mostrou um potente inibidor do vírus influenza in vitro e sua estrutura química é bastante promissora para o desenvolvimento de novas drogas anti-influenza. (AU)

Influenza virus represents one of the main causes of acute respiratory infections, beinga major cause of mortality, morbidity and burden to public health system. The geneticvariability of influenza viruses and broad spectrum of these viruses` hosts impose difficultiesin control strategies through vaccination. Therefore, antiviral drugs have become critical in theprevention and treatment of the infections caused by influenza viruses. There are two classesof anti-influenza drugs, M2 channel blockers (amantadine and rimantadine), which are nolonger used since circulating strains are resistant to these antivirals, and neuraminidaseinhibitors (NAIs oseltamivir and zanamivir), in clinical use. Despite that, oseltamivirresistantstrains have been described. An additional antiviral, ribavirin, is endowed with abroad spectrum activity against DNA/RNA polymerases, although high cytotoxic has beendescribed. Due to the limited number of anti-influenza drugs, studies have been carried out onthe effectiveness of ribavirin and its combination with NAIs for treating influenza infections.Thus, influenza RNA polymerase still is a valid target for development of novel antiviral.Based on that, we aimed here to investigate the antiviral effect of PAR038, a triazolicanalogue of ribavirin. PAR038 is 400-fold potent than ribavirin, with CC50 > 1000 µM andIC50 = 0,07 µM towards MDCKs cytotoxicity and influenza in vitro replication. Ourcompound inhibits influenza RNA polymerase with an EC50 of 1,6 ± 0,15 µM and alsoinhibits viral replication in an A549 cells (IC50 = 21,2 µM).

PAR038 seems to haveimmunomodulatory properties, reducing the levels of IL-8 and MCP-1 on A549 culturesupernatants. We did not find resistance mutations on influenza polymerase after the treatmentwith high levels of PAR038. Thus, PAR038 is a potent inhibitor of influenza polymerase andits chemical structure may be a promising one for the development of novel anti-influenzadrugs. (AU)