Slot blot immunoassay as a tool for plasmid-encoded toxin detection in enteroaggregative Escherichia coli culture supernatants.

Plasmid-encoded toxin (Pet) is a heat-labile enterotoxin encoded in the enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) virulence plasmid. Several evidence support the role of this 108-kDa secreted protein in the pathogenesis of EAEC diarrhea. In this study, we standardized a slot blot immunoassay for Pet detection. EAEC culture supernatants were applied onto a polyvinylidene difluoride membrane, and, using rabbit polyclonal Pet antisera, the expression of the toxin by slot blot immunoassay was observed in 9.5% of the isolates studied. In addition, no negative control reacted with Pet antiserum in this assay. This assay is a rapid, specific, reproducible, and low-cost methodology, therefore demonstrating its potential in diagnosing Pet expression. Moreover, we describe for the first time that expression of Pet can be directly detected from EAEC culture supernatants and may be used in clinical laboratorial routine instead of polymerase chain reaction detection of the pet gene, especially in developing countries where the EAEC pathotype has been considered an emerging pathogen.

Detection of diarrheagenic Escherichia coli from children with and without diarrhea in Salvador, Bahia, Brazil.

We identified different diarrheagenic (DEC) Escherichia coli pathotypes isolated from 1,207 children with and without acute endemic diarrhea in Salvador, Bahia, Brazil collected as part of a case-control study. Since the identification of DEC cannot be based on only biochemical and culture criteria, we used a multiplex polymerase chain reaction developed by combining five specific primer pairs for Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Shiga toxin-producing E. coli/ Enterohaemorrhagic E. coli (STEC/EHEC), Enterotoxigenic E. coli (ETEC) and Enteroaggregative E. coli (EAEC) to detect these pathotypes simultaneously in a single-step reaction. In order to distinguish typical and atypical EPEC strains, these were tested for the presence of EAF plasmid. The prevalence of diarrheagenic E. coli in this sample of a global case-control study was 25.4% (259 patients) and 18.7% (35 patients) in the diarrhea group (1,020 patients) and the control group (187 patients), respectively. The most frequently isolated pathotype was EAEC (10.7%), followed by atypical EPEC (9.4%), ETEC (3.7%), and STEC (0.6%). Typical EPEC was detected only in one sample. The prevalence of the pathotypes studied in children with diarrhea was not significantly different from that in children without diarrhea.

Prevalence of diarrheagenic Escherichia coli in children with diarrhea in Salvador, Bahia, Brazil.

We report the frequency of the different diarrheagenic Escherichia coli (DEC) categories isolated from children with acute endemic diarrhea in Salvador, Bahia. The E. coli isolates were investigated by colony blot hybridization with the following genes probes: eae, EAF, bfpA, Stx1, Stx2, ST-Ih, ST-Ip, LT-I, LT-II, INV, and EAEC, as virulence markers to distinguish typical and atypical EPEC, EHEC/STEC, ETEC, EIEC, and EAEC. Seven of the eight categories of DEC were detected. The most frequently isolated was atypical EPEC (10.1%) followed by ETEC (7.5%), and EAEC (4.2%). EHEC, STEC, EIEC, and typical EPEC were each detected once. The strains of ETEC, EAEC, and atypical EPEC belonged to a wide variety of serotypes. The serotypes of the others categories were O26:H11 (EHEC), O21:H21 (STEC), O142:H34 (typical EPEC), and O:H55 (EIEC). We also present the clinical manifestations and other pathogenic species observed in children with DEC. This is the first report of EHEC and STEC in Salvador, and one of the first in Brazil.

Microbiological monitoring of clean rooms in development of vaccines

The aim of the present work was to evaluate an environmental monitoring program for clean rooms, or classified environments, involved in the filling and quality control of biological products produced by Butantan Institute, São Paulo, Brazil. This monitoring established the quantification, characterization and seasonality of the microorganisms in air and operators and, moreover, determined the alert and action limits. The total detectable microbial number showed some contrasts in installed air purification systems and in the operational impact on adopted procedures. The typical microbial population consisted of Staphylococcus sp, Micrococcus sp, Bacillus sp and Penicillium sp. The highest microorganism concentration occurred during summer and springtime. The established internal alert and action limits supported the operational procedures. Therefore, the environmental monitoring program is recommended for other laboratories involved in the production of vaccines, hyperimmune sera and biopharmaceuticals.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar um programa de monitoramento microbiológico ambiental para áreas limpas, ou ambientes classificados, envolvidas na produção, envasamento e controle dos imunobiológicos produzidos pelo Instituto Butantan. Este monitoramento permitiu a quantificação, a caracterização e a sazonalidade da população microbiana presente no ar e nos operadores, e a determinação dos limites de alerta e ação. O número total de bactérias detectáveis revelou diferenças nos sistemas de purificação de ar instalados e o impacto operacional ocasionado pelos procedimentos realizados. A população microbiana característica foi composta por bactérias dos gêneros Staphylococcus sp, Micrococcus sp, Bacillus sp e por fungos filamentosos do gênero Penicillium sp. A maior concentração de microrganismos ocorreu nos períodos de verão e primavera. Os limites internos de alerta e ação estabelecidos asseguram os procedimentos operacionais, recomendando o monitoramento microbiológico ambiental a outros laboratórios envolvidos na produção de vacinas, soros hiperimunes e imunobiológicos.

Prevalence of diarrheagenic Escherichia coli in children with diarrhea in Salvador, Bahia, Brazil

We report the frequency of the different diarrheagenic Escherichia coli (DEC) categories isolated from children with acute endemic diarrhea in Salvador, Bahia. The E. coli isolates were investigated by colony blot hibridization whit the following genes probes: eae, EAF, bfpA, Stx1, Stx2, ST-Ih, ST-Ip, LT-I, LT-II, INV, and EAEC, as virulence markers to distinguish typical and atypical EPEC, EHEC/STEC, ETEC, EIEC, and EAEC. Seven of the eight categories of DEC were detected. The most frequently isolated was atypical EPEC (10.1 percent) followed by ETEC (7.5 percent), and EAEC (4.2 percent). EHEC, STEC, EIEC, and typical EPEC were each detected once. The strains of ETEC, EAEC, and atypical EPEC belonged to a wide variety of serotypes. The serotypes of the others categories were O26:H11 (EHEC), O21:H21 (STEC), O142:H34 (typical EPEC), and O?H55 (EIEC). We also present the clinical manifestations and other pathogenic species observed in children with DEC. This is the first report of EHEC and STEC in Salvador, and one of the first in Brazil.

Production of cytolethal distending toxin and other virulence characteristics of Escherichia coli strains of serogroup O86

Genetic and phenotypic virulence markers of different categories of diarrhoeagenic Escherichia coli were investigated in 106 strains of enteropathogenic E. coli (EPEC) serogroup O86. The most frequent serotype found was O86:H34 (86 percent). Strains of this serotype and the non motile ones behaved as EPEC i.e., carried eae, bfpA and EAF DNA sequences and presented localised adherence to HeLa cells. Serotypes O86:H2, O86:H6, O86:H10, O86:H18, O86:H27 and O86:H non determined, belonged to other categories. The majority of the strains of serotype O86:H34 and non motile strains produced cytolethal-distending toxin (CDT). The ribotyping analysis showed a correlation among ribotypes, virulence markers and serotypes, thus suggesting that CDT production might be a property associated with a universal clone represented by the O86:H34 serotype

Polyclonal anti-intimin antibody: immunological characterization and its use in EPEC and EHEC diagnosis

Intimins are outer membrane proteins expressed by enteric bacterial pathogens capable of inducing intestinal attachment-and-effacement lesion (A/E). Through immunoblotting, immunofluorescence, flow citometry and immunogold we observed that the obtained polyclonal antibody against conserved intimin region recognizes the different intimin subtypes and suggests that it can be used as a tool for EPEC and EHEC detection. Besides, immuno-dot assay seems to be a possible alternative as a capture method.

EPEC e EHEC constituem um risco significativo para a saúde pública em diferentes partes do mundo. Ambas colonizam a mucosa intestinal e subvertem as funções celulares do epitélio intestinal ao produzirem uma lesão histopatológica característica, conhecida por lesão A/E (attaching-and-effacing), na qual a intimina é uma das proteínas envolvidas. A família das intiminas apresenta também uma região conservada, que compreende os aminoácidos de 388 a 667 (Int 388-667). O objetivo do presente trabalho foi a obtenção de um anticorpo policlonal contra a região conservada de intimina. A caracterização fenotípica das amostras de EPEC e EHEC utilizando este anticorpo permitiu observar-se a maneira variável que ele reconhece os diversos subtipos de intimina e sugere que ele seja uma ferramenta para detecção destes patógenos, sendo o ensaio de immuno-dot o método de captura de escolha.

Capture immunoassay for LT detection produced by enterotoxigenic Escherichia coli in bacterial isolates

A capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which detects LT-I toxin produced by enterotoxigenic Escherichia coli strains, has beendeveloped. This capture assay was performed using the IgG enriched fraction of anti-LT-I antiserum and IgG2b anti-LT-I monoclonal antibody and allowed a clear distinction between E. coli LT-I - producing and non-producing strains. The estimated accuracy of the assay is 78% for sensitivity, 94% for specificity and 92% for efficiency. Thus, the capture immunoassayis a sensitive tool for detection of E. coli, which produces heat-labile enterotoxin, and is suitable for use in clinical laboratories and epidemiological surveys in developing world.

O objetivo do presente trabalho foi a padronização de um imunoensaio de captura para detecção de amostras de E. coli produtoras da toxina LT-I. Este ensaio de captura foi desenvolvido utilizando-se a fração enriquecida em IgG do anticorpo policlonal anti-LT e um anticorpo monoclonal caracterizado como IgG2b. Através deste método verificou-se uma clara distinção entre cepas de E. coli produtoras e não produtoras da toxina (p 0,0001), sendo a sensibilidade do método de 78%, a especificidade de 94% e a eficiência de 92%. Assim, o imunoensaio de captura mostrou-se como uma ferramenta sensível para a detecção de amostras de E. coli que produzem a enterotoxina termo-lábil, podendo ser aplicado em laboratórios clínicos e inquéritos epidemiológicos em paises em desenvolvimento.

Polyclonal anti-intimin antibody: immunological characterization and its use in EPEC and EHEC diagnosis

EPEC e EHEC constituem um risco significativo para a saúde pública em diferentes partes do mundo. Ambas colonizam a mucosa intestinal e subvertem as funções celulares do epitélio intestinal ao produzirem uma lesão histopatológica característica, conhecida por lesão A/E (attaching-and-effacing), na qual a intimina é uma das proteínas envolvidas. A família das intiminas apresenta também uma região conservada, que compreende os aminoácidos de 388 a 667 (Int 388-667). O objetivo do presente trabalho foi a obtenção de um anticorpo policlonal contra a região conservada de intimina. A caracterização fenotípica das amostras de EPEC e EHEC utilizando este anticorpo permitiu observar-se a maneira variável que ele reconhece os diversos subtipos de intimina e sugere que ele seja uma ferramenta para detecção destes patógenos, sendo o ensaio de immuno-dot o método de captura de escolha.

Capture immunoassay for LT detection produced by enterotoxigenic Escherichia coli in bacterial isolates

O objetivo do presente trabalho foi a padronização de um imunoensaio de captura para detecção de amostras de E. coli produtoras da toxina LT-I. Este ensaio de captura foi desenvolvido utilizando-se a fração enriquecida em IgG do anticorpo policlonal anti-LT e um anticorpo monoclonal caracterizado como IgG2b. Através deste método verificou-se uma clara distinção entre cepas de E. coli produtoras e não produtoras da toxina (p< 0,0001), sendo a sensibilidade do método de 78%, a especificidade de 94% e a eficiência de 92%. Assim, o imunoensaio de captura mostrou-se como uma ferramenta sensível para a detecção de amostras de E. coli que produzem a enterotoxina termo-lábil, podendo ser aplicado em laboratórios clínicos e inquéritos epidemiológicos em paises em desenvolvimento.

Polyclonal anti-intimin antibody: immunological characterization and its use in EPEC and EHEC diagnosis

Intimins are outer membrane proteins expressed by enteric bacterial pathogens capable of inducing intestinalattachment-and-effacement lesion (A/E). Through immunoblotting, immunofluorescence, flow citometry andimmunogold we observed that the obtained polyclonal antibody against conserved intimin region recognizesthe different intimin subtypes and suggests that it can be used as a tool for EPEC and EHEC detection.Besides, immuno-dot assay seems to be a possible alternative as a capture method.

Virulence-associated genes diversity in escherichia coli 0128 strains isolated in São Paulo, Brazil

Hundred-three escherichia coli strins of serogroup 0128 were serotyped and fir virulence-associated genes. The 59 representative...

Estudo bacteriológico do suco duodenal e das fezes de 67 crianças diarréicas

O suco duodenal e as fezes de 67 crianças diarréicas foram estudados simultaneamente, com o objetivo de verificar quais os enteropatógenos que poderiam colonizar o intestino delgado, durante um estágio diarréico. O suco duodenal foi obtido de intubaçäo naso-duodenal com sonda nasogástrica estéril. Ambos os materiais foram estudados microbiologicamente através de métodos convencionais, fazendo-se também a contagem de colônicas/ml para o líquido intestinal. Obtivemos resultados positivos em 9(13,43%) das 67 culturas de suco duodenal e em 42 (62,69) das 67 coproculturas. Somente dois dos microrganismos que colonizam o intestino delgado foram isolados do suco duodenal, isto é, Escherichia coli enteropatogênica clássica (EPEC) e Salmonella. EPEC foi enteropatógeno isolado mais frequentemente, tanto do suco duodenal, em 7 casos (10,45%), quanto das fezes, em 23 casos (34,33%). Os sorogrupos 055 e 0111 foram os mais freqüentes. O näo isolamento de outros enteropatógenos do suco duodenal poderia ser atribuído ao nível do intestino delgado, onde se procedeu a coleta, bem como ao estágio em que se encontrava a diarréia. A ausência de outros germes do suco duodenal näo indica que estes näo colonizem o intestino delgado, em algum dos seus vários níveis antômicos

Diarréia protraída: a importância dos agentes enteropatogênicos na sua gênese e fisiopatologia

As causas de diarréia protraída säo muito variáveis e multifatoriais, mas no nosso meio, na grande maioria dos casos, o processo diarréico se perpetua a partir de um episódio inicial de gastroenterite. Nosso objetivo foi investigar o papel dos agentes enteropatogênicos na gênese e na fisipatologia da diarréia protraída. Foram estudados 29 pacientes com idade média de 4,6 meses portadores de diarréia protraída e foram submetidos aos seguintes testes de investigaçäo: cultural de fezes, cultura de secreçäo jejunal, biópsia de intestino delgado e biópsia retal. A cultura de fezes mostrou-se em 17(58,6%) casos; EPEC pertencente os seguintes sorogrupos 0126, 0125, 055, 0111, 0114, 0158, 0119 e Salmonella foram o s agentes isolados. A cultura de secreçäo jejunal revelou crescimento bacteriano em 15 (51,7%) casos, e as seguintes bactérias foram isoladas: EPEC 0142, proteus, Klebsiella, Enterobacter, EPEC 0114, Pseudomonas, EPEC 0111, Salmonella e EPEC 0119. A biópsia jejunal revelou atrofia vilositária subtotal em 13 (44,8%) e a biópsia retal evidenciou colite em 13 (44,8%) pacientes. Estes achados mostram a importância de agentes enteropatogênicos na gênese da diarréia protraída por induzirem alteraçöes morfológicas graves no trato digestivo e por proporcionarem alteraçöes na microecologia graves no trato digestivo e por proporcionarem alteraçöes na microecologia intestinal, o que acarreta o surgimento de intolerâncias alimentares múltiplas, perpetuaçäo da diarréia e agravo nutricional

O uso da associaçäo tinidazol - tioconazol no tratamento das vaginites causadas por Trichomonas, Gardnerella vaginalis ou Candida albicans / The use of tinidazole - tioconazole combination in the treatment of vaginal infection due to Trichomonas, Gardnerella vaginalis or Candida albicans

Estuda-se a eficácia e tolerabilidade da associaçäo tinidazol-tioconazol no tratamento de 60 pacientes portadoras de vulvovaginites causadas por Trichomonas, Gardnerella ou Candida albicans. A associaçäo foi administrada sob a forma de creme vaginal, contendo cada dose 150 mg de tinidazol e 100 mg de tioconazol, aplicada duas vezes ao dia durante três dias. As avaliaçöes clínico-laboratoriais foram realizadas na inclusäo, no 7§ e no 28§ dia após início do tratamento. Foi observada nas 60 pacientes uma reduçäo significativa (p < 0,01) em todos os parâmetros clínicos estudados (corrimento, inflamaçäo, eritema, fissura, odor e prurido) no 7§ e 28§ dias. A avaliaçäo microbiológica revelou no 7§ e 28§ dias 90% e 82%, respectivamente, de ausência do patógeno inicial, sendo estes resultados estatisticamente significativos (p < 0,001). A avaliaçäo clínica global evidenciou resultados excelentes ou bons em 95% das pacientes no 7§ dia e em 88% das mesmas no 28§ dia. Näo foram observadas reaçöes adversas em todo o período de estudo. A associaçäo tinidazol-tioconazol revelou ser bastante eficaz e muito bem tolerada no tratamento destes três tipos de vaginites estudadas

Isolamento e características de cepas de Escherichia coli enteropatogênica isoladas de alimentos / Isolation and characteristics of enteropathogenic Escherichia coli strains isolated from foods

A patogenicidade de 1351 cepas de Escherichia coli isoladas de 287 amostras de alimentos diversos foi estudada, através da sorotipagem para pesquisa de EPEC (E. coli enteropatogênica clássica) e de EIEC (E. coli invasora). A capacidade de produçäo das enterotoxinas LT e ST foi também pesquisada. Observou-se que 5,2% dos alimentos contaminados com E. coli tinham cepas enteropatogênicas, com predominância de ETEC. Entre as EPEC, foram detectados os sorogrupos 026 e 0125. Näo foi observada nenhuma cepa invasora. Entre as cepas de ETEC, predominaram aquelas produtoras apenas da toxina LT pertncentes a vários sorotipos. Nenhuma cepa enteropatoxigênica apresentou os fatores de colonizaçäo CFA/I e CFA/II. Entre as cepas enteropatogênicas isoladas, observaram-se algumas resistentes a um ou mais antibióticos, sendo a maioria sensível aos antibióticos estudados

Estudo da sensibilidade de germes a antimicrobianos in vitro: resultados iniciais em colecistite aguda litiásica / Sensibility assay in vitro of microorganisms to antibiotics: preliminary results in gallstone acute cholecystitis

Pretende-se atualizar os dados microbiológicos em colecistite aguda litásica identificando os microorganismos eventualmente presentes nesta situaçäo, bem como verificar o aspecto de açäo de algumas drogas antimicrobianas atualmente disponíveis. Com este objetivo, säo incluídos 22 doentes operados em regime de urgência, com diagnósticos pré-operatórios de colecistite aguda litiásica. A bile vesicular, colhida por punçäo no intra-operatório, foi semeada em preparados apropriados para o crescimento de germes aeróbios e de anaeróbios. Verificou-se crescimento bacteriano constituído exclusivamente de germes aeróbios, únicos ou associados. Dos germes identificados, houve predominância de Gram-negativso (75,0%). Entre os microorganismos mais freqüentemente identificados figuravam a Escherichia coli, a Klebsiela pneumoniae e o Streptococcus sp. Foram testados 16 antimicrobianos para Gram-negativos e 19 para Gram-positivos. Verificaram diferentes níveis de resistência bacteriana a cada uma destas drogas. As melhores respostas foram obtidas com o Cloranfenicol (Gram+) e com a Cefotaxima sódica e Pefloxacin (Gram-). A Escherichia coli, germe mais freqüente entre aqueles identificados, mostrou-se, mais vezes, sensível à Gentamicina, Pefloxacin, Cefotaxima sódica e Tobramicina. Conclui-se, ao cotejar com os dados disponíveis na literatura, que a microflora nestas situaçöes näo sofreu alteraçäo ao longo do tempo, porém, qualitativamente, há necessidade periódica de se avaliar a sensibilidade destes germes em relaçäo aos antimicrobianos em uso. Atualmente, os antimicrobianos acima relacionados parecem constituir as melhores opçöes terapêuticas frente a infecçöes agudas das vias biliares

Tratamento da diarréia aguda de crianças: estudo comparativo entre Hn-25 Milupa e leite de vaca diluído / Treatment of acute diarrhea of infants: comparative study between Hn-25 Milupa and diluted cow milk

Estudaram-se 127 crianças entre 0 e 18 meses de idade, internadas com doença diarréica aguda e desidrataçäo. Os pacientes foram divididos em dois grupos: um foi alimentado com Hn-25 - MILUPA, alimento dietético especial com reduzido teor de lactose e o outro com leite de vaca diluído em água de arroz: ao 1/2 nos três primeiros dias e aos 2/3 nos dias subseqüentes. Todos os pacientes foram observados por sete dias, avaliando-se a evoluçäo do estado geral, na diarréia, da aceitaçäo alimentar e ganho ponderal/dia. Foram realizados exames laboratoriais, inclusive coprocultura e pesquisa de Rotavírus. Houve diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos do ponto de vista de cura do processo, a favor de Hn-25. Os pacientes portadores de Rotavírus curaram-se todos com Hn-25 o que näo ocorreu com o leite de vaca. Concluiu-se que o Hn-25 foi bem aceito, proporcionou boa evoluçäo e melhora do processo diarréico na maioria dos casos estudados

Efeitos do prebiótico (oligossacarídeo) em leite em pó modificado na flora intestinal: comparação com leite em pó modificado sem prebiótico em estudo duplo-cego / Effects of the prebiotic (ologasaccharide) in modified milk powder on the intestinal flora: comparison with modified milk pwder without prebiotic in a double-blind study

Objetivo: estudar a influência de um prebiótico (oligossacarídeo) acrescido ao leite em pó modificado sobre a flora intestinal de crianças. Métodos: estudo duplo-cego de crianças eutróficas com mais de 1 e menos de 4 anos de idade randomizadas por sorteio em computador a duas dietas: ingestão de leite em pó modificado com adição de prebiótico )n = 14) e leite em pó sem essa adição (n = 14). A oferta de 500 ml/dia dos leites foi feita por 21 dias, de tal maneira que a equipe de pesquisa e a família desconheciam a presença ou não do prebiótico. A análise microbiológica da flora fecal foi realizada antes e após 21 dias de tratamento pelo Laboratório Especial de microbiologia do instituto Butantan. Para a comparação estatística, empregaram-se testes não paramétricos, considerando-se significante p < 0,005. Resultados: ao início do estudo, os dois grupos foram homogêneos em relação ao número de colônias de lacto e bífidos bacilos. Aos 21 dias, o grupo com prebiótico apresentou aumento do número de colônias de lactobacilos muito próximo de significância estatística (p = 0,065) e crescimento altamente significante do número de colônias de bífidos (p = 0,0033). Na comparação entre os grupos após 21 dias de tratamento, constatou-se que o número de colônias de bífidos foi maior no grupo com prebiótico (p = 0,0212).