Causes and consequences of higher Leishmania infantum burden in patients with kala-azar: a study of 625 patients.

BACKGROUND: An infected host's Leishmania infantum load in blood is considered to be an estimate of his or her total parasite burden. Therefore, the measurement of blood parasite burden is important in the identification of factors involved in parasite control. METHODS: Quantitative polymerase chain reaction was performed on blood samples from 625 patients with kala-azar consecutively admitted to a reference hospital in Teresina, Brazil. Primers were used to amplify a segment of kDNA using the TaqMan system. Non-parametric statistical tests were applied. RESULTS: The median blood parasite burden was 499.2 amastigote equivalents (AE)/ml. Children <1 year old (yo) had a high parasite burden, which dropped sharply after the first year of life (192.8, AE/ml at 1 < 2 yo) and remained lower until adolescence. Following adolescence, the parasite burden increased with age, peaking among elderly individuals. Men had a higher parasite burden than women. HIV-infected patients had a much higher parasite burden than non-infected patients. The parasite burden of children under 5 years with acute moderate to severe malnourishment (weight-for-age and body mass index z-scores <-2) was almost three times greater than that of better-nourished children. The parasite burden identified in deceased patients was more than twice that of surviving patients; those with a higher risk of death, sepsis, pneumonia and jaundice also had increased parasite burdens. All of these differences were statistically significant at P-values <0.05. CONCLUSIONS: These data indicate that the parasite burden in patients with kala-azar was associated with age- and gender-associated factors and with HIV infection status. Acute malnutrition could be either a cause or a consequence of a higher parasite burden. An individual's parasite burden influences his or her clinical profile, disease severity and mortality risk. The best explanation for the presence of a higher parasite burden in individuals with these immunoregulatory conditions and severe disease is the occurrence of acquired immunosuppression followed by heightened innate immunity.

Comparación de pruebas moleculares para el diagnóstico de Leishmania spp. en lesiones cutáneas con baja carga parasitaria

Introducción: La leishmaniasis cutánea (LC) es un problema grave de salud pública en Panamá. El diagnóstico de esta parasitosis ha sido siempre desafiante, no sólo debido a su similitud con otras infecciones dérmicas, sino también a características particulares de las lesiones, como cargas parasitarias bajas. ​Materiales y Métodos: En este estudio, se evaluaron mediante cuatro métodos moleculares, 235 muestras de ADN procedentes de lesiones con frotis negativos por LC obtenidas durante el período 2015-2019. Resultados: Los resultados señalan que las sensibilidades encontradas fueron de 75.6% (IC 0.6234-0.8709) para la PCR kDNA-Género específico, de 66.7% (IC 0.5359-0.776) para la PCR Hsp70-Género específico y de 77.6% (IC 0.645-0.8949) para la qPCR 18S ribosomal. Todas las pruebas obtuvieron un valor predictivo positivo de 100%, mientras que el valor predictivo negativo más alto fue con la qPCR (80.58%) y el más bajo con el PCR Hsp70-Género específico (73.2%). En cuanto a la precisión de diagnóstico se obtuvo un rango mayor del 82% en todas las pruebas evaluadas. Conclusión: Este estudio confirma la buena sensibilidad de la PCR kDNA-Viannia para el análisis de lesiones de LC con baja carga parasitaria. Esta metodología es relativamente fácil de estandarizar, por lo que se recomienda su uso en laboratorios clínicos regionales de Panamá. Aun cuando la qPCR 18S ribosomal presentó una sensibilidad relativamente menor, el uso de esta metodología debe ser también considerada por su facilidad de uso, menor tiempo de ejecución y capacidad de cuantificación. (provisto por Infomedic International)

Introduction: Cutaneous leishmaniasis (CL) is a serious public health problem in Panama. The diagnosis of this parasitosis has always been challenging, not only because of its similarity to other dermal infections, but also because of characteristics of the lesions, such as low parasite loads. Materials and Methods: In this study, 235 DNA samples from smear-negative lesions by LC obtained during the period 2015-2019 were evaluated by four molecular methods. Results: The results indicate that the sensitivities found were 75.6% (CI 0.6234-0.8709) for kDNA-Gene-specific PCR, 66.7% (CI 0.5359-0.776) for Hsp70-Gene-specific PCR and 77.6% (CI 0.645-0.8949) for 18S ribosomal qPCR. All tests obtained a positive predictive value of 100%, while the highest negative predictive value was with qPCR (80.58%) and the lowest with Hsp70-Gene-specific PCR (73.2%). In terms of diagnostic accuracy, a range greater than 82% was obtained in all the tests evaluated. Conclusion: This study confirms the good sensitivity of kDNA-Viannia PCR for the analysis of LC lesions with low parasite load. This methodology is relatively easy to standardize, so it is recommended for use in regional clinical laboratories in Panama. Although 18S ribosomal qPCR showed a relatively lower sensitivity, the use of this methodology should also be considered because of its ease of use, shorter execution time and quantification capacity. (provided by Infomedic International)

Efecto de antiparasitarios de uso común en granjas ovinas ubicadas en valledupar, cesar

Introducción: Las enfermedades parasitarias se encuentran entre las causas más frecuentes e importantes que ocasionan repercusiones sanitarias y económicas en las producciones ovinas del país. Objetivo: Determinar la efectividad de los antihelmínticos de uso común en parásitos gastrointestinales de granjas ovinas en Valledupar, Cesar. Métodos: Estudio realizado con 340 ovinos, divididos en 4 granjas (Control, Albendazol, Fenbendazol y Levamisol). Se seleccionaron ovinos con carga parasitaria moderada; se les aplicó tratamiento antihelmíntico y un muestreo postratamiento (15 días). Se evidenciaron los nematodos en estadío infectante (L3) mediante coprocultivo. Resultados: En los grupos tratados Febendazol, Albendazol y Levamisol se pudo obtener una efectividad de 44 %, 65 % y 84 %, con un límite inferior (95 %conf) de 60 %, 70 % y 86 %, respectivamente. No obstante, se evidenciaron diferencias significativas (P<0,05) en cada grupo y entre los grupos tratados. Se recuperaron larvas de Cooperia curticei, Haemonchus contortus, Strongyloides papillosus, Trichostrongylus sp. y Ostertagia sp.

Introduction: Parasitic disease are the most important and frequent cause of sanitary and economic problems in the national sheep farms. Objective: To determine the effectiveness of anthelmintics commonly used in gastrointestinal parasites from sheep farms in Valledupar, Cesar. Method: The study was realized with 340 sheep, divided into 4 farms (control, albendazole, fenbendazole, and levamisole). Sheep with a moderate parasite load were selected and treatment with an-thelmintic, post-treatment sampling was applied (15 days). Nemato-des in the infective stage (L3) were evidenced by stool culture. Results: Groups treated with fenbendazole, albendazole and levamisole had an effectivity of 44%, 65% y 84% with an inferior limit (95% conf.) of 60%, 70%, and 86%, respectively. Nevertheless, significant differences were evidenced (p < 0,05) in each group and between the treated groups. Cooperia curticei, Haemonchus contortus, Strongyloides papillosus, Trichostrongylus sp., and Ostertagia sp. larvae were found.

Estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na liberação de armadilhas extracelulares neutrofílicas (NETs) em resposta a infecção in vitro por Toxoplasma gondii e seu papel no controle da carga parasitária

Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório presente no mundo todo, infectando de forma crônica cerca de um terço da população. A ação do sistema imune contra o parasito é essencial para impedir sua disseminação no organismo e evitar graves consequências. As armadilhas extracelulares neutrofílicas (NETs) formam um mecanismo de defesa mediada por neutrófilos que consiste no descondensamento da cromatina que, associada a histonas e peptídeos antimicrobianos, é liberada para o meio extracelular, aprisionando e matando patógenos. Atualmente se sabe que existe duas formas distintas de liberação de NET: rápida/vital e clássica/tardia. A NET rápida é liberada após poucos minutos de indução e mantêm a viabilidade do neutrófilo, permitindo a realização de outras funções, enquanto a NET clássica ocorre após algumas horas de indução, levando ao rompimento da membrana celular e consequente a morte do neutrófilo. Esse mecanismo foi demonstrado por neutrófilos de diversos hospedeiros intermediários e definitivo do T. gondii, porém o papel das NETs produzidas por neutrófilos humanos em resposta ao parasito e os mecanismos envolvidos no processo ainda necessitam de mais esclarecimento. Sendo assim, nosso objetivo com este trabalho foi caracterizar a produção de NET por neutrófilos humanos em resposta ao T. gondii e seu impacto no controle da carga parasitária. Neutrófilos humanos de indivíduos saudáveis foram incubados com taquizoítos da cepa RH (MOI 5:1) por 15 e 180 minutos, representando NET rápida e clássica, respectivamente. Após infecção, sobrenadantes foram coletados e DNA foi quantificado por PicoGreen. Em paralelo, células foram fixadas e processadas para microscopia de imunofluorescência e eletrônica de varredura (MEV). Ensaios de viabilidade e infectividade do parasito foram realizados após interação entre célula e parasito. Nossos resultados mostram que taquizoítos induzem a liberação de NET rápida e clássica por neutrófilos humanos, sendo essas compostas por DNA, histona H1 e mieloperoxidase, com a presença de vacúolos autofágicos, evidenciadas por microscopia de imunofluorescência. A interação analisada por MEV apontou dois fenótipos distintos das NETs nos tempos avaliados, ambos eficientes na associação com o parasito. Através de ensaio com inibidores farmacológicos confirmamos a participação de PAD4 e elastase neutrofílica para liberação de NET clássica e cálcio, ROS, PI3Kγ e PI3Kδ para NET rápida, sugerindo possível participação de autofagia. Por fim, demonstramos que apesar de aparentar aprisionar os parasitos, as NETs não afetam viabilidade e infectividade do mesmo. Em conjunto, estes dados contribuem com a compreensão de um mecanismo importante da imunidade inata no enfrentamento ao T. gondii

Quantificação da carga parasitária em amostras coletadas de borda interna e externa de lesões cutâneas ulceradas de pacientes com leishmaniose tegumentar americana

As leishmanioses constituem um grupo de doenças infecciosas de transmissão vetorial, causadas por protozoários do gênero Leishmania que acometem o ser humano e animais. No Brasil, a leishmaniose cutânea (LC) é uma doença com registro de casos e de vetores em todo território nacional. A úlcera típica da leishmaniose cutânea é arredondada, indolor, base infiltrada e endurecida, bordas bem delimitadas e elevadas, variando de uma a poucas lesões na maioria dos casos. A pesquisa direta de formas amastigotas, com o auxílio da microscopia ótica, é o método mais simples e tradicional utilizado no diagnóstico da doença. Consiste em pesquisar o parasito em material obtido de escarificação da borda das lesões, sem a necessidade de anestesia local. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) vem alcançando cada vez mais aplicabilidade no campo do diagnóstico das leishmanioses, principalmente por sua alta sensibilidade, superando os métodos diretos. O exame histopatológico, apesar da baixa sensibilidade para o diagnóstico da LC, é útil no diagnóstico diferencial, além de permitir estudar os tipos e a distribuição de células na lesão. Segundo as recomendações da Organização Mundial de Saúde, o local de eleição para coleta de material para diagnóstico da LC é a borda da lesão, pois supõe-se que essa localização contenha a maior quantidade de parasitos. Entretanto, alguns autores têm observado uma maior carga parasitária na borda interna da lesão quando comparado com a borda externa. No Brasil, o Ministério da Saúde recomenda a borda interna. Este estudo tem como objetivo avaliar comparativamente a carga parasitária e o perfil histopatológico na borda interna e externa de lesões cutâneas ulceradas de LC. Para avaliar a diferença quantitativa nas duas localizações, foi utilizada a PCR quantitativa (qPCR) O DNA foi extraído de material de lâminas coletadas previamente, fixadas com metanol e coradas com Giemsa. A quantificação das amostras foi realizada pela qPCR utilizando o sistema SYBR Green com primers direcionados ao minicírculo do kDNA de Leishmania (Viannia) braziliensis e gen \03B2-actina. Foram recuperados blocos de parafina de 19 pacientes, dos quais foram preparadas lâminas coradas pela hematoxilina-eosina para avaliação semi quantitativa dos tipos celulares presentes em cada um dos locais da lesão. Foram analisadas lâminas confeccionadas com material proveniente de escarificação das bordas interna e externa, imprint e histopatologia, totalizando 156 lâminas provenientes, respectivamente, de 39 pacientes diagnosticados com LC. Tanto pela qPCR, quanto pelo exame direto foi possível observar maior carga parasitária na borda interna da lesão em relação à borda externa e imprint. Pela análise histopatológica também foi encontrado um maior índice parasitário na borda interna da lesão. Apesar da menor quantidade de parasitos por lâmina, o imprint permitiu o diagnóstico em 27 pacientes, comparado com 23 diagnósticos na borda interna. Talvez, a menor quantidade de artefatos nas lâminas de imprint facilite a visualização das formas amastigotas. Entretanto, o uso da escarificação na rotina de diagnóstico apresenta vantagens, por ser uma técnica simples, pouco invasiva, que não requer anestesia e que pode ser realizada repetidas vezes, por profissional não médico, em áreas endêmicas. Portanto, os resultados sugerem que a escarificação da borda interna da lesão seja o método indicado para coleta de amostras com fins de diagnóstico molecular e exame direto

Detección de Trypanosoma cruzi en tejido y sangre murina por PCR convencional y en tiempo real / Detection of Trypanosoma cruzi in murine blood and tissue by conventional and real time PCR / Detecção de Trypanosoma cruzi em tecido e sangue murinos por PCR convencional e em tempo real

El objetivo del presente trabajo fue comparar la detección de ADN de Trypanosoma cruzi mediante PCR en tiempo real (qPCR) y PCR convencional en sangre periférica (n=25) y músculo esquelético (n=20) de ratones tratados con drogas tripanomicidas luego de 6 meses post-tratamiento. En las muestras de sangre se detectaron un total de 7 positivas por qPCR, mientras que por PCR convencional sólo se detectaron 2. En músculo esquelético, 15 muestras fueron positivas por qPCR y 3 por PCR convencional. Los resultados obtenidos demuestran que la fuerza de concordancia es débil entre las técnicas de PCR utilizadas para la detección de ADN de T. cruzi (k=0,37; 49% positivas por qPCR vs. 11% por PCR convencional, p=0,0001). En las muestras de sangre, los valores diagnósticos de qPCR con respecto a la PCR convencional fueron: 100% sensibilidad; 78% especificidad; 30% VPP; 100% VPN; 4,6 RVP; 0 RVN. Para las muestras de músculo esquelético se obtuvieron los siguientes valores diagnósticos de qPCR: 100% sensibilidad; 29% especificidad; 20% VPP; 100% VPN; 1,4 RVP; 0 RVN. Ambas técnicas fueron igualmente sensibles en el rango de mediana-alta concentración, pero qPCR fue más efectiva para detectar bajas cargas parasitarias, en particular en las muestras de tejido.

The aim of this work was to compare detection of Trypanosoma cruzi DNA by real time (qPCR) and conventional PCR in peripheral blood (n=25), and skeletal muscle (n=20) of mice treated with trypanocidal compounds after 6 months post-treatment. A total of 7 blood samples were positive by qPCR; whereas, by conventional PCR only 2 were detected. In skeletal muscle, 15 samples were regarded positive by qPCR and 3 by conventional PCR. These results showed a weak concordance strength among PCR techniques employed to detect T. cruzi DNA in the studied samples (k=0.37; 49% positives by qPCR vs. 11% by conventional PCR, p=0.0001). In blood samples, qPCR diagnostic values in comparison with conventional PCR were: 100% sensibility; 78% specificity; 30% PPV; 100% NPV; 4.6 PVR; 0 NVR. For skeletal muscle samples, qPCR diagnostic values were: 100% sensibility; 29% specificity; 20% PPV; 100% NPV; 1.4 PVR; 0 NVR. Both techniques were equally sensitive in the medium-high concentration range, but qPCR was more effective to detect low parasitic burden, particularly in skeletal muscle samples.

O objetivo deste estudo foi comparar a detecção de DNA de Trypanosoma cruzi por PCR em tempo real (qPCR) e PCR convencional no sangue periférico (N=25) e músculo esquelético (N= 20) de camundongos tratados com medicamentos tripanomicidas depois de 6 meses de pós-tratamento. Nas amostras de sangue foi detectado um total de sete positivas por qPCR; enquanto que apenas foram encontradas 2 por PCR convencional. No músculo esquelético, 15 amostras foram positivas por qPCR e 3 por PCR convencional. Os resultados mostram que a força de concordância é fraca entre as técnicas de PCR utilizadas para a detecção de DNA de T. cruzi (k=0,37, 49% positivas por qPCR vs. 11% para a PCR convencional, p=0,0001). Nas amostras de sangue, os valores diagnósticos de qPCR em relação a PCR convencional foram de 100% sensibilidade; 78% de especificidade; 30% de VPP; 100% VPN; 4,6 RVP; 0 RVN. Para as amostras de músculo esquelético, os seguintes valores diagnósticos de qPCR foram obtidos: 100% sensibilidade; 29% de especificidade; 20% de VPP; 100% VPN; 1,4 RVP; 0 RVN. Ambas as técnicas são igualmente sensíveis na faixa de concentração média-alta, mas qPCR foi mais eficaz na detecção de baixas cargas parasitárias, especialmente em amostras de tecido.

Gastrointestinal nematode infections in sheep raised in Botucatu, state of São Paulo, Brazil / Infecções por nematódeos gastrintestinais em ovinos criados em Botucatu, estado de São Paulo, Brasil

Gastrointestinal nematode infections were evaluated in sheep raised in Botucatu, state of São Paulo, Brazil between April 2008 and March 2011. Every month, two tracer lambs grazing with a flock of sheep were exposed to natural infection with gastrointestinal nematodes for 28 consecutive days. At the end of this period, the lambs were sacrificed for worm counts. Haemonchus contortus presented 100% of prevalence. The seasons exerted no significant influence on the mean intensity of H. contortus, which ranged from 315 worms in November 2010 to 2,5205 worms in January 2011. The prevalence of Trichostrongylus colubriformis was also 100%, with the lowest mean intensity (15 worms) recorded in February 2011 and the highest (9,760 worms) in October 2009. In the case of T. colubriformis, a significant correlation coefficient was found between worm counts vs. rainfall (r = −0.32; P <0.05). Three other nematodes species were found in tracer lambs, albeit in small numbers. Their prevalence and mean intensity (in parenthesis) were as follows: Oesophagostomum columbianum 28% (25.2), Cooperia curticei 7% (4.5) and Trichuris spp. 2% (1). In conclusion, the environmental conditions of the area proved to be highly favorable for the year-round transmission of H. contortus and T. colubriformis.

A ocorrência de infecções por nematódeos gastrintestinais foi avaliada de abril de 2008 até março de 2011em ovinos criados em Botucatu, estado de São Paulo. Todos os meses, dois cordeiros traçadores foram expostos à infecção natural por nematódeos gastrintestinais, durante 28 dias consecutivos, ao pastejar junto com um rebanho de ovelhas. Ao final desse período, os animais foram sacrificados para a identificação e quantificação dos helmintos. Haemonchus contortus apresentou prevalência de 100%. Não houve influência significativa das estações do ano na intensidade média de H. contortus, que variou de 315 vermes em novembro/2010 a 25.205 vermes em janeiro/2011. Trichostrongylus colubriformis também apresentou prevalência de 100% com a menor intensidade média (15 vermes) em fevereiro/2011 e a maior (9.760 vermes) em outubro/2009. No caso de T. colubriformis, houve correlação significativa entre as contagens de vermes x precipitação (r = −0,32; P <0,05). Outras três espécies de nematódeos foram encontradas nos cordeiros traçadores, no entanto em pequenas quantidades, com as seguintes prevalências e intensidades médias (entre parênteses): Oesophagostomum columbianum 28% (25,2), Cooperia curticei 7% (4,5) e Trichuris spp. 2 % (1). Em conclusão, as condições ambientais da área foram muito favoráveis durante todo o ano para a transmissão de H. contortus e T. colubriformis.

Ensaios moleculares quantitativos e baseados em temperatura de dissociação do DNA para diagnóstico específico da infecção por Leishmania spp

A leishmaniose é uma doença negligenciada, presente na Europa, Ásia, África e nas Américas, abrangendo infecções assintomáticas e duas formas clínicas principais: Leishmaniose Visceral (LV) e Leishmaniose Tegumentar (LT). É causada por protozoários do gênero Leishmania, transmitidos pela fêmea de flebotomíneos vetores. Sabe-se que as diferentes espécies de Leishmania estão associadas às diferentes formas clínicas da doença e ao seu prognóstico. O diagnóstico da leishmaniose é feito a partir da combinação de dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais, mas principalmente através do isolamento e cultivo dos parasitos, que pode ser seguido de ensaio de isoenzimas para identificação da espécie. Este processo, contudo, tem baixa eficiência, além de demandar tempo e recursos que podem ser minimizados com a utilização de abordagem molecular diretamente em material clínico. A técnica de PCR em tempo real (qPCR) tem sido amplamente utilizada para detecção da infecção por Leishmania e para a quantificação da sua carga parasitária, por se tratar de uma metodologia simples, rápida e extremante sensível, capaz de detectar concentrações muito baixas de parasitos presentes em uma amostra A análise de curvas de dissociação por High Resolution Melting (HRM) tem como principal vantagem permitir investigar toda a região amplificada pelos iniciadores e tem sido utilizada para a identificação de espécies por apresentar uma sensibilidade capaz de identificar diferenças de até um nucleotídeo entre sequências de DNA. A realização de um estudo que estabeleça uma metodologia capaz de detectar e identificar espécies de Leishmania, e que inclua uma validação analítica para uma padronização adequada e permita a determinação da carga parasitária em paralelo, para possibilitar a associação desses dados, ainda se faz necessária. Assim, o objetivo deste trabalho é estabelecer uma metodologia baseada em qPCR e HRM, que dispense o isolamento e cultivo do parasito, e que permita a detecção, identificação de espécies de Leishmania e a quantificação da carga parasitária diretamente em material clínico. Para isso, as metodologias de qPCR e HRM foram padronizadas com cepas de referência e posteriormente validadas com amostras clínicas de pacientes de Rondônia, Brasil, diagnosticados com leishmaniose cutânea, sendo realizada a quantificação da carga parasitária por qPCR e a identificação da espécie envolvida por HRM. Os resultados apontam que o alvo HSP70 é melhor indicado para determinar a carga parasitária de Leishmania. Além disso, estabelecemos um algoritmo para a identificação das principais espécies de Leishmania de relevância clínica por HRM, a partir da combinação de dois alvos moleculares, HSP70 e COI.

Quantification of Leishmania infantum DNA in the bone marrow, lymph node and spleen of dogs / Quantificação de DNA de Leishmania infantum em medula óssea, linfonodo e baço de cães

The aim of the present study was to quantify the parasite load of Leishmania infantum in dogs using real-time PCR (qPCR). Bone marrow, lymph node and spleen samples were taken from 24 dogs serologically positive for L. infantum that had been put down by the official epidemiological surveillance service. According to the clinical signs the dogs were classified as asymptomatic or symptomatic. After DNA extraction, the samples were subjected to qPCR to detect and quantify L. infantum DNA. Out of the 24 dogs, 12.5% (3/24) were classified as asymptomatic and 87.5% (21/24) as symptomatic. Real-time PCR detected L. infantum DNA in all the animals, in at least one biological sample. In particular, 100% of bone marrow and lymph node scored positive, whereas in spleen, the presence of DNA was detected in 95.9% (23/24). In addition, out of 24 animals, 15 were microscopically positive to amastigote forms of L. infantum in bone marrow. No statistical significant difference was found in the overall mean quantity of DNA among the different biological samples (P = 0.518). Considering each organ separately, there was 100% positivity in bone marrow and lymph nodes, while among the spleen samples, 95.9% (23/24) were positive. Regarding the different clinical groups, the overall mean parasite load varied significantly (P = 0.022). According to the results obtained, it was not possible determine which biological sample was most suitable tissue for the diagnosis, based only on the parasite load. Therefore, other characteristics such as convenience and easily of obtaining samples should be taken into consideration.

O objetivo do presente estudo foi quantificar a carga parasitária de Leishmania infantum em cães pela técnica de PCR em tempo-real (qPCR). Amostras de medula óssea, linfonodo e baço foram obtidos de 24 cães sorologicamente positivos para L. infantum que foram submetidos à eutanásia pelo serviço de vigilância oficial. Segundo os sinais clínicos, os animais foram classificados em assintomáticos ou sintomáticos. Após extração de DNA, as amostras foram submetidas à qPCR para detecção e quantificação de DNA de L. infantum. Dos 24 cães, 12,5% (3/24) foram classificados como assintomáticos e 87,5% (21/24) como sintomáticos. A PCR em tempo real detectou DNA de L. infantum em 100% dos animais, em pelo menos uma amostra biológica. Considerando cada órgão isoladamente, foi observada uma positividade de 100% em medula óssea e linfonodo, já nas amostras de baço 95,9% (23/24) foram positivas. Não foi observada diferença estatística entre a quantidade média geral de DNA entre as diferentes amostras biológicas (P = 0,518). Considerando os diferentes grupos clínicos, a carga parasitária média geral variou significantemente (P = 0,022). De acordo com os resultados obtidos não foi possível eleger a mais apropriada amostra biológica para o diagnóstico, baseado apenas na carga parasitária. Portanto, outras características como a conveniência e a facilidade de obtenção da amostra devem ser consideradas.

Influência dos inflamassomos AIM2, NLRP3 e da carga parasitária na patogênese da leishmaniose tegumentar americana por Leishmania (Viannia) braziliensis: estudo de preditores de prognóstico

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada por grande variedade de espécies do gênero Leishmania. A LTA apresenta intenso polimorfismo clínico, que pode variar desde quadro assintomático, até lesões desfigurantes. No Brasil L. (V.) braziliensis é a espécie dermotrópica mais amplamente distribuída. Até recentemente a abordagem dos fatores imunes relacionados à LTA era quase que restrita ao estudo da imunidade adquirida. Entretanto, a relação entre parasita e hospedeiro começa a ser definida já na fase inicial da infecção, regida pela imunidade inata. Esta resposta é mediada nos fagócitos profissionais que interagem, entre outros, com um conjunto de receptores não clonais, denominados de receptores de reconhecimento de padrões (PRR), destinados a reagir aos padrões moleculares relacionados aos patógenos (PAMP), ou padrões moleculares relacionados ao perigo (DAMP). Os inflamassomos canônicos são um conjunto de receptores citosólicos, que ao serem ativados por PAMP ou DAMP, iniciam um processo de montagem de plataforma proteica responsável pela ativação autocatalítica da pró-caspase-1, que irá ativar a IL-1\03B2 e IL-18. O objetivo deste trabalho foi avaliar fatores preditores de evolução de doença através da análise dos inflamassomos canônicos AIM2 e NLRP3 e IL-1\03B2 tanto in vitro como in vivo e a carga parasitária in vivo. Os estudos in vivo abordaram culturas de queratinócitos humanos HaCat e células de linhagem monocítica humana THP1 transformadas em macrófagos, cocultivadas com a cepa infectiva código internacional MHOM/BR/2000/LTCP-13396 de L. (V.) braziliensis. Nestes ensaios não foi possível relacionar as coculturas com a expressão gênica do NLRP3, AIM2 ou IL-1\03B2. Avaliamos ainda, lesões ativas de pacientes com LTA no Rio de Janeiro, área endêmica de L. (V.) braziliensis e relacionamos com apresentação clínica e resposta à terapia com Glucantime®. Na PCR em tempo real, a expressão gênica do AIM2 foi mais baixa na leishmaniose cutânea localizada, comparada com a forma mucosa. Houve uma redução da expressão do AIM2 nos pacientes com a leishmaniose cutânea localizada com boa resposta ao tratamento quando comparados com a pele normal, indicando que nesta forma deve haver um mecanismo de inibição da expressão do AIM2. Na análise pela imunohistoquímica observamos significativo aumento percentual de células AIM2+ em pacientes com má resposta ao tratamento, quando comparados aos pacientes que responderam bem ao tratamento. Encontramos ainda, um predomínio de células AIM2+, comparadas com células NLRP3+, demonstrando que o AIM2 foi mais abundante do que o NLRP3. Embora a expressão gênica do NLRP3 tenha sido detectada em cerca de 77% dos casos, foi possível visualizar células NLRP3+ em apenas 25% das amostras. Na literatura, a produção e a atividade do GP63, fator de virulência expresso nas espécies de Leishmania, vem sendo associada à uma redução da secreção da IL-1\03B2, possivelmente em decorrência da clivagem do NLRP3. Logo, o GP63 pode estar relacionado à escassez de células NLRP3+. Os nossos dados demonstram que o AIM2 é um inflamassomo importante na LTA e está diretamente associado à gravidade das lesões. Avaliamos também a carga parasitária pela PCR em tempo real com a quantificação absoluta utilizando a subunidade menor de Leishmania do gene RNA (SSR). Não encontramos uma relação entre a carga parasitária e os achados clínicos, mas os nossos dados confirmam a afirmação anterior de que infecções crônicas por L. (V.) braziliensis se associam com parasitismo escasso.

Do young Carollia perspicillata (Chiroptera: Phyllostomidae) present higher infestation rates of Streblidae (Diptera)? / Jovens de Carollia perspicillata (Chiroptera: Phyllostomidae) apresentam maiores taxas de infestação de Streblidae (Diptera)?

Ecological aspects related to parasitism are one of the less studied issues in parasitology research, and the scarce evidence available supports that younger specimens present higher infestation rates. The purpose of this work is to establish if higher infestation rates are observed in nursing females and their young captured inside their roost. Bats were captured inside a shelter located in RPPN Estação Veracel, Santa Cruz de Cabrália, Bahia state, Brazil. A total of 56 individuals of Carollia perspicillata were observed, 17 captured inside the roost during the day and 39 in trails at night. Captures of C. perspicillata during the day in a shelter yielded similar infestation rates to bats netted in trails and higher prevalence. The hypothesis that young were more infected was confirmed, based on the higher infestation of nursing females with neonates and on the significant inverse relation between body weight and number of parasites in young and subadults.

Aspectos ecológicos relacionados ao parasitismo são uma das questões menos estudadas em parasitologia e poucas evidências sobre indivíduos jovens apresentando maiores taxas de infestações estão disponíveis.O objetivo deste trabalho é estabelecer se a taxa de infestação mais elevada é observada em fêmeas lactantes e jovens capturados dentro de seu refúgio. Os morcegos foram capturados dentro de um abrigo localizado na RPPN EstaçãoVeracel, Santa Cruz deCabrália-Bahia, Brasil. Um total de 56 indivíduos de Carollia perspicillata foi observado, sendo que 17 indivíduos foram capturados dentro do refúgio, durante o dia, e 39 foram capturados em trilhas, à noite. Indivíduos de C. perspicillata capturados durante o dia no abrigo apresentaram índices de infestação semelhantes aos morcegos capturados em trilhas e maior prevalência. A hipótese de que jovens eram maisinfectados foi confirmada, com base na maior infestação de fêmeas com recém-nascidos e na relação inversa significativa entre o peso corporal e o número de parasitas em jovens e subadultos.

Avaliação de taxas de infecção, carga parasitária e tipagem molecular de Trypanosoma cruzi em triatomíneos provenientes do Ceará (Caatinga) e Rio Grande do Sul (Pampa)

Embora o Brasil mantenha constante a operação de vigilância e controle dos principais vetores da doença de Chagas, o risco de transmissão do Trypanosoma cruzi ainda persiste. Estimativas de taxas de infecção natural por T. cruzi em triatomíneos são importantes para avaliar um possível risco de transmissão vetorial. Deste modo, o objetivo do presente estudo é estimar taxas de infecção natural, carga parasitária e caracterização de linhagens de T. cruzi diretamente de triatomíneos capturados em dois biomas brasileiros: Caatinga e Pampa. A técnica de PCR convencional multiplex, por apresentar maior sensibilidade, reprodutibilidade e fidedignidade, comparada à observação microscópica direta do parasito, foi utilizada para a detecção simultânea do DNA cinetoplástico de T. cruzi e da subunidade 12S do gene ribossomal de triatomíneos. Para a estimativa da carga parasitária por qPCR, foram realizados ensaios de quantificação absoluta utilizando o sistema TaqMan multiplex, com o mesmo alvo para triatomíneos e empregando o DNA nuclear satélite de T. cruzi. A caracterização molecular do parasito foi realizada a partir de adaptações dos algoritmos de PCR preconizados previamente. A PCR convencional multiplex demonstrou sensibilidade superior à microscopia para o diagnóstico de triatomíneos coletados. No Ceará o percentual de positividade para T. cruzi, por PCR, foi maior em P. lutzi (6/7; 85,7%), seguido de T. brasiliensis (29/158; 18,4%) e T. pseudomaculata (28/230; 12,2%). As maiores cargas parasitárias observadas foram em T. pseudomaculata e T. brasiliensis (9,1 × 107 e 1,9 × 107 equivalentes de parasito, respectivamente), e a menor em P. lutzi (1,2 × 10-2 equivalentes de T. cruzi). O genótipo TcI foi detectado em T. brasiliensis, T. pseudomaculata e P. lutzi; e as DTUs TcV, TcII e TcVI em T. brasiliensis. Coinfecções por TcIII+V e TcI+II/V/VI foram observadas em P. lutzi e em T. brasiliensis, respectivamente. T. brasiliensis infectados com TcII e TcVI apresentaram cargas parasitárias mais altas (1,8 × 107 e 1,9 × 107 equivalentes de parasito, respectivamente). No Rio Grande do Sul a taxa de infecção natural foi superior em T. rubrovaria (4/8; 50%), seguido de T. circummaculata (3/9; 33,3%), T. infestans (10/123; 8,1%) e T. carcavalloi (2/33; 6,1%). Entre os Triatoma sp., 4,8% (11/228) foram positivas para T. cruzi. A maior carga parasitária foi observada em T. rubrovaria (3 × 107 equivalentes de parasito) e as mais baixas em Triatoma sp. e T. infestans (1,5 × 101 e 2,1 × 101 equivalentes de T. cruzi, respectivamente). TcI foi encontrada em T. rubrovaria, T. infestans e Triatoma sp.. T. circummaculata continha coinfecção por TcI+IV. A presença de triatomíneos infectados por T. cruzi nos ambientes domiciliar e peridomiciliar sugerem um possível risco de transmissão em humanos nas regiões estudadas. Além disso, os dados apresentados demonstram que o ciclo de transmissão de T. cruzi nos diferentes ecótopos é altamente complexo e que a distribuição geográfica dos genótipos do parasito é subestimada no Brasil, sendo necessárias novas investigações para uma melhor compreensão acerca da interação parasito-vetor-hospedeiro-reservatório. O presente estudo confirmou a fidedignidade das técnicas moleculares empregadas para a avaliação de triatomíneos naturalmente infectados por T. cruzi.