Delayed gametocyte clearance in Plasmodium vivax malaria is associated with polymorphisms in the cytochrome P450 reductase (CPR).

Primaquine (PQ) is the main drug used to eliminate dormant liver stages and prevent relapses in Plasmodium vivax malaria. It also has an effect on the gametocytes of Plasmodium falciparum; however, it is unclear to what extent PQ affects P. vivax gametocytes. PQ metabolism involves multiple enzymes, including the highly polymorphic CYP2D6 and the cytochrome P450 reductase (CPR). Since genetic variability can impact drug metabolism, we conducted an evaluation of the effect of CYP2D6 and CPR variants on PQ gametocytocidal activity in 100 subjects with P. vivax malaria. To determine gametocyte density, we measured the levels of pvs25 transcripts in samples taken before treatment (D0) and 72 hours after treatment (D3). Generalized estimating equations (GEEs) were used to examine the effects of enzyme variants on gametocyte densities, adjusting for potential confounding factors. Linear regression models were adjusted to explore the predictors of PQ blood levels measured on D3. Individuals with the CPR mutation showed a smaller decrease in gametocyte transcript levels on D3 compared to those without the mutation (P = 0.02, by GEE). Consistent with this, higher PQ blood levels on D3 were associated with a lower reduction in pvs25 transcripts. Based on our findings, the CPR variant plays a role in the persistence of gametocyte density in P. vivax malaria. Conceptually, our work points to pharmacogenetics as a non-negligible factor to define potential host reservoirs with the propensity to contribute to transmission in the first days of CQ-PQ treatment, particularly in settings and seasons of high Anopheles human-biting rates.

Monoamine oxidase-A (MAO-A) low-expression variants and increased risk of Plasmodium vivax malaria relapses.

OBJECTIVES: Primaquine is essential for the radical cure of Plasmodium vivax malaria and must be metabolized into its bioactive metabolites. Accordingly, polymorphisms in primaquine-metabolizing enzymes can impact the treatment efficacy. This pioneering study explores the influence of monoamine oxidase-A (MAO-A) on primaquine metabolism and its impact on malaria relapses. METHODS: Samples from 205 patients with P. vivax malaria were retrospectively analysed by genotyping polymorphisms in MAO-A and cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) genes. We measured the primaquine and carboxyprimaquine blood levels in 100 subjects for whom blood samples were available on the third day of treatment. We also examined the relationship between the enzyme variants and P. vivax malaria relapses in a group of subjects with well-documented relapses. RESULTS: The median carboxyprimaquine level was significantly reduced in individuals carrying low-expression MAO-A alleles plus impaired CYP2D6. In addition, this group experienced significantly more P. vivax relapses. The low-expression MAO-A status was not associated with malaria relapses when CYP2D6 had normal activity. This suggests that the putative carboxyprimaquine contribution is irrelevant when the CYP2D6 pathway is fully active. CONCLUSIONS: We found evidence that the low-expression MAO-A variants can potentiate the negative impact of impaired CYP2D6 activity, resulting in lower levels of carboxyprimaquine metabolite and multiple relapses. The findings support the hypothesis that carboxyprimaquine may be further metabolized through CYP-mediated pathways generating bioactive metabolites that act against the parasite.

Computational Chemogenomics Drug Repositioning Strategy Enables the Discovery of Epirubicin as a New Repurposed Hit for Plasmodium falciparum and P. vivax.

Widespread resistance against antimalarial drugs thwarts current efforts for controlling the disease and urges the discovery of new effective treatments. Drug repositioning is increasingly becoming an attractive strategy since it can reduce costs, risks, and time-to-market. Herein, we have used this strategy to identify novel antimalarial hits. We used a comparative in silico chemogenomics approach to select Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax proteins as potential drug targets and analyzed them using a computer-assisted drug repositioning pipeline to identify approved drugs with potential antimalarial activity. Among the seven drugs identified as promising antimalarial candidates, the anthracycline epirubicin was selected for further experimental validation. Epirubicin was shown to be potent in vitro against sensitive and multidrug-resistant P. falciparum strains and P. vivax field isolates in the nanomolar range, as well as being effective against an in vivo murine model of Plasmodium yoelii Transmission-blocking activity was observed for epirubicin in vitro and in vivo Finally, using yeast-based haploinsufficiency chemical genomic profiling, we aimed to get insights into the mechanism of action of epirubicin. Beyond the target predicted in silico (a DNA gyrase in the apicoplast), functional assays suggested a GlcNac-1-P-transferase (GPT) enzyme as a potential target. Docking calculations predicted the binding mode of epirubicin with DNA gyrase and GPT proteins. Epirubicin is originally an antitumoral agent and presents associated toxicity. However, its antiplasmodial activity against not only P. falciparum but also P. vivax in different stages of the parasite life cycle supports the use of this drug as a scaffold for hit-to-lead optimization in malaria drug discovery.

Falha Terapêutica na malária por Plasmodium vivax: investigação de fatores relacionados à metabolização de primaquina e estudo de polimorfismos relacionados à resistência aos antimaláricos

A cura radical da malária causada por Plasmodium vivax requer a administração de um esquizonticida sanguíneo para matar os parasitos do estágio sanguíneo e a adição de uma droga capaz de matar os hipnozoítos, estágios latentes do parasito que residem no fígado de pacientes infectados. Atualmente, a primaquina (PQ) é o único medicamento usado para o tratamento de hipnozoítos. No entanto, os efeitos da PQ podem variar de um indivíduo para outro. A família de enzimas do complexo citocromo P450 (CYP) é responsável pela metabolização de antimaláricos como a cloroquina, mefloquina e PQ. Por ser uma pró-droga, a PQ depende da sua ativação que é realizada através da enzima CYP2D6, responsável por reações de redução e oxidação do fármaco e produção de matabólito ativo contra os hipnozoítos. Além da via das CYPs, a PQ também sobre desaminação oxidativa através da via da monoaminoxidase-A (MAO-A). Essa via está associada à produção do metabólito mais abundante da PQ, a carboxi-PQ, e é responsável pela meia vida curta da droga. A ocorrência de polimorfismos nesses genes levam a diferentes respostas terapêuticas, definidas pelos fenótipos: metabolizador lento, intermediário e rápido. Além de fatores ligados ao hospedeiro, a falha terapêutica pode estar associada a fatores do parasito, representado pela resistência do parasito aos antimaláricos. Para P. vivax, os estudos tem se concentrado na genotipagem molecular de pvcrt-o (chloroquine resistance transporter) e pvmdr1 (multidrug resistance gene-1), genes ortólogos a pfcrt e pfmdr1 de P. falciparum associados à resistência aos antimaláricos. O presente estudo teve como objetivo estudar a influência de fatores genéticos do hospedeiro, enzimas envolvidas na metabolização de primaquina, e genes do parasito que estão sob forte pressão seletiva e que são candidatos à resistência aos antimaláricos, na resposta terapêutica da infecção por Plasmodium vivax. A prevalência de indivíduos com atividade reduzida de CYP2D6 (fenótipos gPM, gIM e gNM-S) foi de 32,6% (31/95), semelhante a frequência de indivíduos com MAO-A disfuncional 37% (37/100). Nesse estudo, a atividade enzimática das duas enzimas foi correlacionado ao número de episódios de recorrências da malária. Apenas CYP2D6 parece influenciar as recidivas de P. vivax (P = 0,012; Teste de Qui-Quadrado), enquanto MAO-A não apresentou uma associação estatisticamente significativa com o número de recidivas de malária. É importante ressaltar que nosso achados em relação da metabolização da PQ mostraram a possibilidade da MAO-A ser intensificadora do efeito de CYP2D6 disfuncional nos indivíduos. As análises in silico mostraram que alguns SNPs em pvmrp1 e pvmrp2 devem ter um efeito na exportação de moléculas como drogas antimaláricas. Contudo, nossas análises de variabilidade genética dos genes pvmrp1 e pvmrp2 do P. vivax indicam que os SNPs identificados a partir do sequenciamento de isolados da Amzônia brasileira não apresentam uma relação evidente com o número de episódios de recorrências. Em conjunto, nossos achados têm implicações diretas para os esforços atuais de controle da malária, uma vez que uma parcela significativa dos indivíduos com malária por P. vivax podem não responder adequadamente ao tratamento devido a atividade alterada de CYP2D6. Além disso, a identificação de SNPs que possam estar relacionados a uma maior tolerância do P. vivax à PQ-CQ poderão direcionar futuras pesquisas a respeito da resistência do parasito aos antimaláricos.