Acute exposure to hyperosmotic conditions reduces sperm activation by urine in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae, a freshwater teleost fish / Exposição aguda a condições hipereosmoticas reduz ativação do sêmen por urina em lambari do-rabo-amarelo (Astyanax altiparanae), um teleósteo de água doce

In freshwater fish with external fertilization, sperm sampling can be contaminated with urine, which triggers motility and gives rise to decreased fertilization success. The maintenance of freshwater fish in hyperosmotic conditions may reduce urine production and improve sperm quality. Thus, the aim of this work was to verify if acute exposure to various NaCl concentrations improves sperm quality in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae. Spermiation was induced using a single dose of carp pituitary gland (5 mg kg-1) and the males were maintained at various NaCl concentrations: NaCl 0.00% (control), NaCl 0.45% (hypoosmotic), NaCl 0.9% (isosmotic) and NaCl 1.0% (hyperosmotic) for 6 h at 26 °C. Sperm was collected and verified for activation by urine and motility traits. At 0.00%, 0.45%, and 0.90%, the sperm was motile just after sampling, indicating activation by urine. Surprisingly, at hyperosmotic conditions, no activation was observed. Other sperm and motility parameters did not show any statistical differences, including sperm viability (P = 0.7083), concentration (P = 0.9030), total motility (P = 0.6149), VCL (curvilinear velocity; P = 0.1216), VAP (average path velocity; P = 0.1231) and VSL (straight-line velocity; P = 0.1340). Our results indicate that acute maintenance at hyperosmotic conditions eliminates sperm activation by urine and maintains sperm quality. Such a new procedure is interesting for both basic and applied sciences, including reproductive practice in fish.(AU)

Em peixes de água doce com fertilização externa, a amostragem de espermatozoides pode ser contaminada pela urina, o que desencadeia motilidade e gera menor sucesso na fertilização. A manutenção de peixes de água doce em condições hiperosmóticas pode reduzir a produção de urina e melhorar a qualidade do esperma. Assim, o presente trabalho foi delineado para verificar se a exposição aguda a várias concentrações de NaCl melhora a qualidade do esperma no tetra-amarelo Astyanax altiparanae. A espermiação foi induzida usando uma dose única de hipófise da carpa (5 mg kg-1) e os machos foram mantidos em várias concentrações de NaCl: NaCl 0,00% (controle), NaCl 0,45% (hipoosmótico), NaCl 0,9% (isosmótico) e NaCl 1,0% (hiperosmótico) por seis horas a 26 °C. O esperma foi colhido e verificado quanto à ativação por urina e traços de motilidade. Em 0,00%, 0,45%, 0,90% os espermatozóides eram móveis logo após a amostragem, indicando ativação pela urina. Surpreendentemente, em condições hiperosmóticas, nenhuma ativação foi observada. Outros parâmetros espermáticos e de motilidade não mostraram diferenças estatísticas, incluindo viabilidade espermática (P = 0,7083), concentração (P = 0,9030), motilidade total (P = 0,6149), VCL (Velocidade Curvilinear; P = 0,1216), VMD (Velocidade Média de Deslocamento; P = 0,1230) e VLR (Velocidade em linha Reta; P = 0,1340). Nossos resultados indicam que a manutenção aguda em condições hiperosmóticas elimina a ativação do esperma pela urina e mantém a qualidade do esperma. Esse novo procedimento é interessante para as ciências básicas e aplicadas, incluindo a prática reprodutiva em peixes.(AU)

Comparison of different methods for exogenous DNA uptake by bovine spermatozoa / Comparação de diferentes métodos de incorporação de DNA exógeno pelo espermatozoide bovino

Although genetic manipulation of farm animals is of great interest for animal production and the pharmaceutical industry, its efficiency remains far from satisfactory. Pronuclear injection, which is the most widely used technique for such modification, mainly in mice, remains limited for this species. Some alternatives have been developed such as sperm mediated gene transfer, in which the spermatozoa are used as vectors for DNA delivery during in vitro fertilization. Mature sperm cells are able to spontaneously bind exogenous DNA molecules which may be internalized into sperm nuclei. Given the potential of sperm mediated gene transfer for livestock animals transgenesis, the aim of this study was to evaluate four methods of DNA uptake for sperm mediated gene transfer in bovine: incubation with DNA, plasma membrane alteration induced by calcium ionophore followed by incubation with DNA, electroporation and lipofection. Spermatozoa not exposed to exogenous DNA were used as control group. Cleavage, blastocyst and hatching rates were recorded at 72 hours post insemination (hpi), days 9 and 12 of embryo culture, respectively. Exogenous DNA-positive embryos were evaluated by PCR. No effect of treatment was observed on cleavage, blastocyst and hatching rates. In addition, percentage of DNA positive blastocysts did not differ among experimental groups. In spite of the low number of positive embryos, our results show that all treatments presented similar efficiencies for DNA delivery during in vitro fertilization. In conclusion, although the development rates were similar and constant in all groups, other factors such as exogenous DNA sequence, size and concentration should be considered to improve sperm mediated gene transfer.

Apesar da manipulação genética de animais domésticos ser de grande interesse para a produção animal e para a indústria farmacêutica, a sua eficiência ainda é insatisfatória. A injeção pronuclear, a técnica mais utilizada para tal propósito, principalmente em camundongos, ainda apresenta limitações para esta espécie. Algumas alternativas têm sido desenvolvidas como o uso de espermatozoides como vetores para transferência gênica, na qual a célula espermática tem habilidade espontânea de se ligar à molécula de DNA e internalizá-la. Dado o potencial da transferência gênica mediada por espermatozoide para animais domésticos transgênicos, o objetivo do presente trabalho foi a avaliação de quatro métodos de incorporação de DNA para a transferência gênica mediada por espermatozoides na espécie bovina: incubação com DNA, alteração da membrana plasmática induzida por cálcio ionóforo seguida por incubação com o DNA exógeno, eletroporação e lipofecção. Espermatozoides não expostos ao DNA exógeno foram usados como grupo controle. Os índices de clivagem, blastocisto e eclosão foram avaliados, respectivamente, as 72 horas após a inseminação dos oócitos, bem como, aos 9 e 12 dias de cultivo embrionário. Os embriões positivos para o DNA exógeno foram avaliados por PCR. Nenhum efeito de tratamento foi observado nos índices de clivagem, blastocisto e eclosão. Além disso, a porcentagem de blastocistos positivos para o DNA exógeno não diferiu entre os grupos experimentais. Apesar do baixo número de embriões positivos para DNA exógeno, os resultados obtidos mostram que todos os tratamentos apresentaram eficiências similares. A conclusão obtida foi que, apesar de os índices de desenvolvimento embrionário terem sido similares e constante em todos os grupos experimentais, outros fatores como a sequência, o tamanho e a concentração do DNA exógeno devem ser avaliados para melhorar a transferência gênica mediada por espermatozoides.

Alterações celulares induzidas pelo estresse térmico em embriões bovinos / Cellular alterations induced by heat stress in bovine embryos

Condições ambientais adversas, tais como altas temperaturas e umidade relativa, causam aumento da temperatura cor- poral interna (hipertermia) de vacas lactantes, que resultam em estresse térmico e diminuição dos índices de gestação. A susceptibilidade embrionária à temperatura elevada já foi bem caracterizada tanto em experimentos in vivo quanto in vitro. A exposição de embriões bovinos em estágios de zigoto e duas células à temperatura elevada diminui o desenvol- vimento embrionário até o estágio de blastocisto. No entanto, o embrião torna-se mais resistente aos efeitos deletérios da temperatura elevada à medida que progride no desenvolvimento. A redução na competência de desenvolvimento embrionária causada pelo estresse térmico deve-se, em parte, às inúmeras alterações citoplasmáticas e nucleares in- duzidas pela temperatura elevada. No citoplasma embrionário, o choque térmico aumenta o número de mitocôndrias edemaciadas, desorganiza os microtúbulos e os filamentos de actina. No compartimento nuclear, a temperatura elevada induz a fragmentação de DNA característica de apoptose. Essa forma de morte celular é um fenômeno regulado ao lon- go do desenvolvimento embrionário pré-implantacional, visto que altas temperaturas não ativam a cascata de apoptose em embriões de duas ou quatro células. A apoptose embrionária induzida pelo choque térmico em embriões > 16 célu- las pode ser considerada um mecanismo de controle de qualidade para remoção dos blastômeros danificados, já que o bloqueio da apoptose nestes embriões aumenta ainda mais a susceptibilidade ao choque térmico. Além disso, o estresse térmico também pode afetar o estado redox do embrião, levando a um consequente estresse oxidativo.

Adverse environmental conditions such as high temperature and humidity increase internal body temperature (hyperthermia) of lactating dairy cows resulting in heat stress and decreased pregnancy rates. Embryonic suscepti-bility to elevated temperature has been well characterized both in vivo and in vitro. Exposure of zygote and two cells stage bovine embryos to elevated temperature decreases embryonic development to the blastocyst stage. However, the bovine embryo becomes more resistant to the deleterious effects of heat stress as it proceeds in its development. The heat-induced reduction in embryonic developmental competence is due, at least in part, to the numerous cytoplasmic and nuclear changes induced by high temperature. In the embryo cytoplasm heat shock increases the number of swollen mitochondria, disrupts microtubules and microfilaments. In the nuclear compartment, elevate temperature induces DNA fragmentation characteristic of apoptosis. This form of cell death is a phenomenon regulated throughout the preimplantation embryonic development, since high temperatures do not trigger apoptosis in embryos of two or four cells. Heat-induced apoptosis in embryos > 16 cells can be seen as a quality control mechanism for removing damaged blastomeres, since block apoptosis in these embryos increase its susceptibility to heat shock. Furthermore, heat stress can also affect the redox status of the embryo inducing a consequent oxidative stress.

Gene expression profile of Protamines and Transition Nuclear Proteins in bovine testis / Expressão gênica de protaminas e proteínas nucleares de transição em testículos bovinos

Protamines (PRM) are the major DNA-binding proteins in the sperms nucleus and can pack the DNA into than 5% of the volume of a somatic cell nucleus. It is already know that bulls only have the PRM1 protein on mature spermatozoa while most mammals also have the PRM2. Transition nuclear proteins (Tnps) and PRMs are fundamental to DNA integrity. It has already been reported the influence of PRM on chromatin structures, generating low fertility. However, molecular mechanisms underlying these effects are not known. The relative expression of PRM1, PRM2, PRM3, Tnp1 and Tnp2 was determined by real time RT-PCR, using bovine specific primers and β-actin as endogenous control. Quantification of mRNA relative expression showed a higher expression of PRM1 compared to the other genes. The PRM3 mRNA had the lowest relative expression. A significant (p < 0.05) and positive correlation was found between PRM1 and PRM2 (r = 0.518), PRM2 and Tnp1 (r = 0.750), PRM2 and Tnp2 (r = 0.706), PRM3 and Tnp1 (r = 0.542), PRM3 and Tnp2 (r = 0.731) and between Tnp1 and Tnp2 (r = 0.820). Since most of the knowledge about protamine 2 in bovine is based on a work from 1990 and according to new studies we know that PRM1 and PRM2 are important to bull fertility, more research is needed to elucidate the real function of protamines on bovines.

Protaminas (PRM) são as principais proteinas ligantes do DNA espermático e podem compactar o núcleo do espermatozóides em menos de 5% do volume de uma célula somática. Ká se sabe que o touro produz apenas a PRM1 em espermatozoide maduro, enquanto a maioria dos mamíferos também produz a PRM2. As proteínas nucleares de transição (Tnps) e as PRMs são fundamentais para a integridade do DNA. Já foi descrita a influência das protaminas na estrutura da cromatina e a associação destas com a fertilidade. Entretanto, os mecanismos moleculares que geram mudanças na cromatina espermática são desconhecidos. A expressão relativa da PRM1, PRM2, Tnp1 e Tnp2 foi determinada para dez testículos de touros oriundos de matadouros comerciais, utilizando a técnica de RT-PCR em tempo real, com primers específicos para bovinos e a B-actina como controle endogeno. Ao quantificar a expressão relativa do RNAm, detectou-se alta expressão relativa da PRM1, em comparação aos outros genes. A expressão relativa da PRM3 foi a menor de todos os genes. Foram encontradas correlações positivas e significantes (p < 0,05) entre PRM1 e PRM2 (r = 0,518), PRM2 e Tnp1 (r = 0,750), PRM2 e Tnp2 (r = 0,706), PRM3 e Tnp1 (r = 0,542), PRM3 e Tnp2 (r = 0,731) e entre Tnp1 e Tnp2 (r = 0,820). Visto que a maioria dos conhecimentos sobre a PRM2 estão baseados em um trabalho de 1990 e, de acordo com recentes estudos se sabe que a PRM1 e a PRM2 são importantes para a fertilidade do touro, mais estudos são necessários para determinar a real função das protaminas em touros.

Maturação e desenvolvimento embrionário in vitro de oócitos bovinos após bloqueio da meiose com inibidores de MPF / In vitro maturation and embryo development of bovine oocytes after meiosis blockage with MPF inhibitors

O objetivo deste estudo foi avaliar a maturação e o desenvolvimento embrionário após a fecundação in vitro de oócitos bovinos que tiveram a maturação bloqueada com Butirolactona I e Roscovitina em meio de pré-maturação suplementado com soro fetal bovino (SFB). Oócitos foram divididos em 4 grupos: Controle 0 hora, Controle (maturação por 24 horas), Butirolactona I (bloqueio da maturação com 150μM de Butirolactona I por 24 horas, seguido de 24 horas de maturação) e Roscovitina (bloqueio da maturação com 50μM de Roscovitina por 24 horas, seguido de 24 horas de maturação). Para avaliar a maturação nuclear, os oócitos foram fixados e corados em aceto orceína. Parte dos oócitos dos grupos Controle 24 horas, Roscovitina e Butirolactona I após o período de maturação, foi fecundado in vitro. O desenvolvimento embrionário foi avaliado pelos índices de clivagem (D3) e formação de blastocistos (D7). Oócitos do grupo Butirolactona I apresentaram índices de Vesícula Germinativa após o bloqueio e de Metáfase 2 após a maturação semelhantes ao dos grupos Controle 0 hora e Controle, respectivamente. Por outro lado, a Roscovitina apresentou menores índices de Vesícula Germinativa e Metáfase 2. Os grupos Controle e Butirolactona I apresentaram maiores índices de clivagens. O grupo Controle apresentou maior produção de blastocistos que o Roscovitina e não diferiu do grupo Butirolactona I. Conclui-se que a Butiroloactona I pode ser utilizada no sistema de pré-maturação em meio contendo SFB, pois apresentou resultados semelhantes ao do grupo Controle o mesmo não ocorrendo com a Roscovitina, que apresentou menores índices de maturação oocitária e de desenvolvimento embrionário.

This study evaluated the bovine oocyte maturation and embryo development after in vitro fertilization. The maturation of the oocytes was blocked using Butyrolactone I and Roscovitine using pre-maturation medium supplemented with fetal calf serum (FCS). The ocytes were divided in four groups: Control 0 hour, Control (24 hours of maturation), Roscovitine (maturation blockage with 50mM Roscovitine during 24 hours followed by 24 hours of maturation), and Butyrolactone I (maturation blockage with 150mM Butyrolactone I during 24 hours followed by 24 hours of maturation). The oocytes were fixed and stained with aceto orcein to evaluate the nuclear maturation. After the maturation period, the remaining oocytes of the Control group, Roscovitine, and Butyrolactone I were fertilized in vitro. Embryo development was assessed by the cleavage rate (D3) and blastocysts formation (D7). The Butyrolactone I group had similar rates of germinal vesical stage oocytes during blockage, and Metaphase 2 after maturation, comparing to Control group at 0 hour and Control group, respectively. On the other hand, the Roscovitine group had lower rates of vesical stage oocytes during blockage, and Metaphase 2 after maturation comparing to Control groups. After in vitro fertilization, higher rates of cleavage were observed in Control and Butyrolactone I groups. For the blastocyst formation rate, the Control group showed better results than Roscovitine group. In summary, Butyrolactone I group had similar results to the Control group, and for this reason, is suitable for pre-maturation of bovine oocytes using FCS. In contrast, Roscovitine group had lower oocyte maturation and embryo development.

In vitro development of bovine embryos cultured under different fetal calf serum concentrations and cell types / Desenvolvimento in vitro de embriões bovinos cultivados sob diferentes concentrações de soro fetal bovino e tipos celulares

The present work was carried out to evaluate the in vitro development of bovine embryo co-cultured in granulosa, oviduct, BRL or VERO cells co-cultures, supplemented with 5% or 10% of Fetal Calf Serum (FCS). Cummulus oocyte complexes were aspirated, matured and fertilized in vitro. Embryonic structures were divided into eight treatments. They were placed in culture media TCM 199 containing granulosa, oviduct, BRL or VERO cells, each of them added with 5% or 10% FCS. The conditions for the co-culture were 38.5 ºC, 5% CO2 in air and high humidity for ten consecutive days. Cleavage, blastocyst and hatching rates did not differ (p > 0.05) in co-culture with primary cells (granulosa and oviduct) when FCS concentration increased from 5 to 10%. However, in continuous cells co-culture (BRL and VERO), when FCS concentration increased from 5% to 10%, the blastocyst development rate decreased significantly (p < 0.05) from 33.6 to 16.3% and from 40 to 16.5% in embryo co-culture with BRL and VERO cells, respectively.

O presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o desenvolvimento in vitro de embriões bovinos co-cultivados em células da granulosa, do oviduto, BRL e VERO, suplementados com 5% ou 10% de Soro Fetal Bovino (SFB). Os complexos cummulus oócitos foram aspirados, maturados e fecundados in vitro. As estruturas embrionárias foram divididas em oito tratamentos: co-cultivo em TCM 199 contendo células da granulosa, do oviduto, BRL ou VERO adicionadas com 5% ou 10% de SFB. As condições de cultivo foram 38.5 ºC, 5% CO2 em ar e alta humidade por dez dias consecutivos. Os índices de clivagem, blastocisto e eclosão não diferiram (p > 0,05) no co-cultivo com células primárias (granulosa e oviduto) quando a concentração de SFB aumentou de 5 para 10%. Entretanto, no co-cultivo com células de linhagens contínuas (BRL e VERO), quando a concentração de SFB aumentou de 5% para 10%, os índices de blastocistos diminuíram significativamente (p < 0,05) de 33,6 para 16,3 % e de 40 para 16,5% nos embriões bovinos co-cultivados com células VERO e BRL, respectivamente.

Reproductive performance of sows inseminated with diluted semen treated with homeopathic medicine

Aims: this study sought to assess the reproductive performance of sows inseminated with sperm treated with homeopathic medicines. Materials and methods: the semen of 2 sexually mature boars age 18 months Pietrain and Duroc cross-bred with similar genetic and reproductive performance were chosen, as well as 125 sows. Sixteen samples of semen were collected and standardized through semen evaluation. Three homeopathic preparations and a placebo (control) were tested on the sperm (n=31/32 per group): Avena sativa 6cH, Pulsatilla nigricans 6cH and Avena sativa 6cH + Pulsatilla nigricans 6cH. Sows were inseminated 3 times with the same estrous diagnostic procedures. Results: there was significant difference (p<0.05) between Avena sativa 6cH and the other 3 groups regarding the return to estrus and parturition rate. There was no significant difference among the groups regarding the number of newborn piglets. Conclusion: these data suggest that homeopathic preparation Avena sativa may be used directly on sperm cells to improve the parturition rate in technified swine farms.

Objetivos: este estudo buscou avaliar o rendimento reprodutivo de suínos inseminados com esperma tratado com medicamentos homeopáticos. Materiais e métodos: o esperma de dois suínos sexualmente maduros de 18 meses de idade híbridos Pietrain e Duroc, com rendimento genético e reprodutivo similares foi selecionado, assim como 125 fêmeas. Dezesseis amostras de esperma foram coletadas e estandarizadas através de avaliação do esperma. Três preparações homeopáticas e um controle (placebo) foram testados no esperma (n=31/32 por grupo): Avena sativa 6cH, Pulsatilla nigricans 6cH and Avena sativa 6cH + Pulsatilla nigricans 6cH. As fêmeas foram inseminadas 3 vezes com os mesmos procedimentos de diagnóstico do estro. Resultados: houve diferença significativa (p< 0,05) entre Avena sativa 6cH e os outros 3 grupos no retorno ao estro e taxa de partos. Não houve diferença significativa entre os grupos no número de recém-nascidos. Conclusão: os dados sugerem que a preparação homeopática Avena sativa pode ser utilizada diretamente nas células espermáticas para melhorar a taxa de partos em fazendas tecnificadas de criação de suínos.

Objetivos; este estudio busco evaluar el rendimiento reproductivo de porcinos inseminados com esperma tratado com medicamentos homeopáticos. Materiales y métodos: el esperma de 2 porcinos sexualmente maduros de 18 meses de edad híbridos Pietrain y Duroc, com rendimiento genético y reproductivo similares fue seleccionado, así como 125 hembras. Dieciséis muestras de esperma fueron recogidas y estandarizadas mediante evaluación del esperma. Tres preparados homeopáticos y un control (placebo) fueron testeados en el esperma (n=31/32 por grupo): Avena sativa 6cH, Pulsatilla nigricans 6cH and Avena sativa 6cH + Pulsatilla nigricans 6cH. Las hembras fueron inseminadas 3 veces con los mismos procedimientos de diagnóstico del estro. Resultados: hubo diferencia significativa (p< 0,05) para Avena sativa 6cH en comparación con los demás grupos en el retorno al estro y tasa de partos. No hubo diferencia significativa entre ninguno de los grupos en el número de recién nacidos. Conclusión: estos datos sugieren que el preparado homeopático Avena sativa puede ser directamente utilizado en las células espermáticas para mejorar la tasa de partos en granjas tecnificadas de porcinos.Palabras llave: porcinos; rendimiento reproductivo; esperma; homeopatía; estudio ciego controlado.

Kinetics of changes in plasma membrane related to apoptosis and necrosis in bovine sperm cells at different incubation times

Incubation time induce damages in sperm cells by necrosis and/or apoptosis. The aim of this study was the evaluation of changes in plasma membrane related to apoptosis and necrosis in bovine sperm cells through 2 hours of incubation. Sperm cells were incubated at 5% (v/v) CO subscribed to 2 in air for 0, 30, 60, 90 and 120 minutes. After each period, sperm cells were incubated with fluorescent probes Yo-pro and propidium iodide (PI) to detect change in plasma membrane related to apoptosis and necrosis respectively. Using Yo-pro/PI assay, three different subpopulations of sperm cells were detected by flow cytometry: a) necrotic sperm cells (PI superscript + and Yo-pro superscript to -/+); b) apoptotic sperm cells (Yo-pro superscript to+ and PI superscript to-) and c) living cells (Yo-pro superscript to- and PI superscript to-). The percentage of live cells (plasma membrane integrity) significantly decreases over 2 hour of incubation, on the other hand, the percentage of necrotic and apoptotic cells increase during incubation. Changes in plasma membrane integrity were correlated to incubation time. While live cells were negatively correlated with the increase of incubation time, necrosis and apoptosis were positively correlated. It was also observed that necrosis was the main damage in sperm cells in all incubation times. In conclusion, incubation time induces changes in plasma membrane integrity related to necrosis and apoptosis, whether necrosis is present in higher quantity in all incubation times.

O tempo de incubação causa danos nas células espermáticas relacionados a necrose e/ou apoptose. O objetivo deste estudo foi avaliar as mudanças na membrana plasmática relacionadas a apoptose e necrose em espermatozóides bovinos durante 2 horas de incubação. Os espermatozóides foram incubados a 5% (v/v) CO subscrito por 2 em ar por 0, 30, 60, 90 e 120 minutes. Depois de cada periodo, as células espermáticas foram incubadas com as sondas fluorescentes Yo-pro e iodito de propideo (PI) para detectar mudanças na membrana plasmática relacionadas a apoptose e a necrose, respectivamente. Usando Yo-pro/PI assay, três subpopulações diferentes de células espermáticas são detectadas pelo citômetro de fluxo: a) células espermáticas em necrose (PI elevado a+ and Yo-pro elevado a-/+); b) células espermáticas em apoptose (Yo-pro elevado a+ and PI elevado a-) e c) células espermáticas vivas (Yo-pro- and PI elevado a-). A porcentagem de células vivas (membrana plasmática integra) significativamente diminui durante 2 horas de incubação, por outro lado, a porcentagem de espermatozóides em necrose e apoptose aumentaram durante a incubação. As mudanças na integridade da membrana plasmática foram correlacionadas com o tempo de incubação. Enquanto as células vivas foram correlacionadas negativamente com o aumento do tempo de incubação, necrose e apoptose foram correlacionadas positivamente. Também foi observado que necrose foi o principal dano causado pelo tempo de incubação nas células espermáticas. Conclui-se que o tempo de incubação causa alteração na integridade da membrana plasmática relacionadas a necrose e apoptose nas células espermáticas, sendo que necrose foi observada em maior quantidade em todos os tempos de incubação.

Influência do glicerol e etilenoglicol e da criopreservação sobre o complexo DNA-Proteina de espermatozóides em garanhões / Glycerol, ethyleneglycol and cryopreservation influences on semen an sperm DNA-Protein complex in stallion

O processo de criopreservação causa estresse físico e químico aos espermatozóides, acarretando alterações bioquímicas, diminuição irreverssível da motilidade espermática, aumento da degeneração do DNA e liberação intracelular de enzimas e lipídeos. No presente estudo, foram estudadas a influência das estações não reprodutiva e reprodutiva, dos crioprotetores glicerol e etilenoglicol e do processo de congelação e descongelação sobre o complexo DNA-proteína de espermatozóides em garanhões. Foi comparados o sêmen puro, o sêmen puro e congelado sem crioprotetores, o sêmen diluído e exposto aos crioprotetores sem congelação e o sêmen diluído e congelado com crioprotetores. Foram utilizados seis garanhões, colhendo 12 ejaculados cada. A patologia do complexo DNA-Proteína foi avaliada em espermatozóides fixados com etanol-ácido-acético glacial 3: 1 (v/ v), tratados com HCL 4N a 25°C e corados com azul de toluidina a 0,025% em tampão McIlvaine, empregando microscopia óptica com aumento de 1000x. Os resultados mostraram que a anomalia do complexo DNA-Proteína dos espermatozóides diferem entre os grupos congelados e não congelados (P<0,05). O sêmen congelado sem crioprotetor não apresentou aumento significativo de patologia do complexo DNA-Proteína em relação ao sêmen congelado com crioprotetores, mas ambos mostraram aumento em relação ao sêmen puro ou diluído e exposto aos crioprotetores. A influência da estação reprodutiva mostrou diferença significativa (P<0,05) somente no sêmen puro e no sêmen puro e congelado sem crioprotetor. Conclui-se que o processo de congelação exerce influência negativa sobre o complexo DNA-Proteína de espermatozóides em garanhões.

The cryopreservation process cause stress physical and chemical to the spermatozoa, causing biochemistry alteration, irreversible reduction of the spermatic motility, increase of the DNA degeneration and intracellular enzyme and lipids release. The aim of this study was to evaluate the influence of non-breeding and breeding seasons, glycerol and ethylene glycol, cryopreservation and thawing processes on stallion spermatozoa DN A -protein complexo It was compared fresh semen, diluted semen frozen without cryoprotectants, diluted semen exposured to cryoprotectants but not frozen and d) diluted semen frozen with cryoprotectants. Six stallions had 12 semen collections each. DNA-protein complex pathology was assessed by optical microscopy (1000x) using spermatozoa treated with ethanol-acetic acid 3:1 (v/v), HCl 4N at room temperature and toluidin blue 0,025% in McIlavaine buffer. Results showed that DNA-protein complex were different between frozen and not frozen spermatozoa groups (P<0,05). Frozen semen without cryoprotectants had no increasing of DNA-protein complex pathology compared to semen cryopreserved with cryoprotectant, but both showed increasing in relation to fresh and diluted semen exposured to cryoprotectants. The influence of non breeding and breeding season showed significant difference (P<0,05) in the fresh semen and fresh semen frozen without cryoprotectants. Cryopreservation process had negative influence on spermatozoa DNA-protein complex.

Indução da ovulação em vacas com gonadotrofina coriônica humana (hCG) purificada por cromatografia de afinidade / Induction of ovulation in cows with affinity chromatography-purified Human Chorionic Gonadotropin (hCG)

O objetivo do presente estudo foi purificar o hCG contido em uma preparação comercial (Pregnyl® Organon) por cromatografia de afinidade e avaliar a taxa de ovulação de vacas injetadas com o hormônio purificado. Uma coluna de cromatografia contendo matriz de Concanavalina-A Sepharose (Con-A) foi equilibrada e cem milunidades internacionais (UI) de Pregnyl® foram aplicadas na coluna. Frações de 3,8mL foram colhidas (4 º C) a cada 5 minutos durante 12,5 horas, resultando em um total de 150 frações. Após a fração 76 adicionou-se à coluna solução tampão contendo 0,3M de alfa−metilglicosidase. A concentração protéica das frações foi estimada por espectrofotometria (280nm). Foram observados dois picos de absorbância, um entre as frações 14 e 19 e outro entre as frações 90 e100. As frações 14 a 19 e 90 a 150 foram reunidas seqüencialmente aos pares, concentradas por ultrafiltração e analisadas por SDS-PAGE. O primeiro pico resultou da eluição das proteínas não adsorvidas pela matriz de Con-A, enquanto o segundo representou as proteínas adsorvidas pela coluna, especialmente o hCG. As frações contendo hCG foram reunidas em uma única amostra cuja concentração protéica foi quantificada pelo método de Lowry. Vacas no 5º dia de um ciclo estral sincronizado, apresentando um folículo dominante maior que 8mm de diâmetro, foram injetadas com 0,1, 0,2 ou 0,3mg de proteína contida na amostra purificada. Após 48 horas, a taxa de ovulação observada foi de 0%, 50% e 75%, respectivamente. Foi demonstrado no presente estudo que a técnica de cromatografia por afinidade foi eficiente para aumentar a concentração relativa do hCG preservando sua atividade biológica.

Objective of the present study was to purify hCG contained in commercial preparation (Pregnyl®- Organon) by affinity chromatography and to evaluate ovulation rates in cows injected with the purified hormone. A chromatography column containing concanavalin-A sepharose (Con-A) matrix was equilibrated and one hundred thousand international units (UI) of Pregnyl® were applied to the column. Fractions of 3,8mL were collected (4 degree C) every 5 minutes for 12,5h, to yield a total of 150 fractions. After fraction 76, a column buffer containing 0,3M alpha-methylglicoside was added to the column. Protein concentrations were estimated by espectrophotometry(280nm). Two peaks of absorbance were observed, between fractions 14 and 19, and fractions 90 and 100. Fractions 14-19 and 90-150 were sequentially grouped in pairs concentrated by ultrafiltration andanalyzed by SDS-PAGE. The first peak of absorbance resulted from proteins contained in the commercial product, eluted from the column and not adsorbed by the Con-A matrix. The second peak represented proteins adsorbed by the column, especially hCG. The fractions containing hCG were grouped in a single sample and protein concentration was measured by the Lowry method. Cows in day 5 of the estral cycle, which had a dominant follicle larger than 8mm, were injected with 0,1, 0,2 or 0,3mg protein of the purificated sample. The ovulation rate 48 hours after treatment was 0%, 50% and 75%,respectively. It was demonstrated that relative concentration of hCG can be increased by affinity chromatography and biological activity of purified hCG was satisfactory preserved.

Avaliação de bioensaios para a determinação da atividade biológica da gonadotrofina coriônica humana (hCG) / Evaluation of bioassays for measuring the of biological activity of Human Chorionic Gonadotropin (hCG)

A atividade biológica de um hormônio é mensurada pela sua capacidade em exercer um determinado efeito biológico que possa ser quantificado. Os ensaios biológicos in vivo que avaliam a atividade do hCG baseiam-se na sua capacidade de promover um aumento de peso do sistema genital, vesículas seminais e próstata em ratos impúberes e útero e ovários em camundongas impúberes. A partir destes efeitos, determinam-se equações relacionando as doses de hCG administradas com o aumento de peso do sistema genital. O objetivo do presente estudo foi avaliar a eficiência de bioensaios em mensurarem a atividade biológica do hCG utilizando ratos, ratas e camundongas impúberes. No experimento 1, ratos receberam 0, 4, 8 ou 16UI de hCG, a cada 24 horas, durante 4 dias. A próstata e/ou as vesículas seminais foram pesadas 24 horas após a última injeção. No experimento 2, camundongas receberam 0, 3,33, 10, 33,3 ou 100UI de hCG, em um único dia. Os ovários e/ou útero foram pesados 24horas após a última injeção. O hCG promoveu aumento de peso do sistema genital de camundongas, entretanto, não houve associação linear ou quadrática significativa entre as doses de hCG utilizadas e os pesos das variáveis medidas, impossibilitando a determinação de equações confiáveis. Os protocolos testados, com as doses de hCG utilizadas demonstraram eficiência e sensibilidade limitadas para a quantificação da atividade biológica do hCG.

Biological activity of a given hormone is measured by its capacity to exert a specific, quantifiable biological effect. Aim of biological assays that measure activity of hCG is to construct prediction equations that associate increasing doses of hCG with changes in weights of genitalia, seminal vesicles and prostate gland in pre-pubertal male rats and weights of uterus and ovaries in pre-pubertal female mice. Objective of the present study was to evaluate efficiency of bioassays which used pre-pubertal male rats and female rats and mice to measure hCG activity. In experiment 1, male rats received 0, 4, 8 or 16IU of hCG daily, for 4 days. Prostate and seminal vesicles were weighed 24 hours after last injection. In experiment 2, female mice received 0, 3.33, 10,33.33 or 100IU of hCG in one day. Ovaries and uteri were weighed24 hours after the last injection. The hCG increased weights of genitaliain female mice. However, there were no satisfactory linear or quadratic associations between doses of hCG used and variables measured. Itwas concluded that assays tested showed only limited efficiency and sensibility to quantify hCG biological activity.

Criopreservação e desenvolvimento in vitro de embriões bovinos / Cryopreservation and in vitro survival of bovine embryos

O objetivo deste trabalho foi estudar a remoção do crioprotetor, em duas ou três etapas, em embriões bovinos produzidos in vitro após a congelação em vapor de Nirtogênio. Blastocistos expandidos (1329) foram mantidos em co-cultivo (controle) ou criopreservados em 3 protocolos de congelação em vapor de nitrogênio. Os embriões foram equilibrados na solução de 10% de EG por 10 minutos e em 17%, 22% ou 28% de EG por 30 segundos. Após o envase, as palhetas foram mantidas em vapor de nitrogênio por 2 minutos e armazenadas em nitrogênio líquido. Após a descongelação, os crioprotetores foram diluídos em duas etapas, usando 0,3M de sacarose e solução isotônica ou em três etapas usando 0,3M de sacarose + 10% de EG; 0,3M de sacarose e solução isotônica. Os embriões foram co-cultivados com células da granulosa, avaliando as taxas de re-expansão após 24 horas e de eclosão após 24, 48, 72 e 96 horas. Para os grupos congelados no vapor e diluição do crioprotetor em duas etapas, as taxas de eclosão foram de 1,94; 11,88 e 6,06% para EG17, EG 22 e EG 28 respectivamente. Já para os grupos com diluição do crioprotetor em três etapas, as taxas de eclosão foram de 4,67; 9,90 e 10,78% para EG17, EG22 e EG28 respectivamente.

The aim of this study was to evaluate the dilution of cryoprotectant in 2 or steps of bovine in vitro-produced embryos after quick-freezing. A total of 1329 expanded blastocyst were kept in co-culture as control group or cryopreserved by 3 quick-freezing protocols. The embryos were exposed to 10% EG for 10 minutes then to 17%, 22% or 28% for 30 seconds. After loading, the straws were held in nitrogen vapor for 2 minutes and then plunged and stored in liquid nitrogen. After warming, cryoprotectants were diluted in two steps using 0.3 M sucrose and isotonic solution, or three steps using 0.3 M sucrose + 10% EG then 0.3 M sucrose and isotonic solution. Embryos were co-cultured on a granulosa cell monolayer and evaluated after 24 hours for re-expansion and at 24, 48, 72 and 96 hours of co-culture for hatching rates. The in vitro survival rates of embryos cryopreserved by the quick-freezing method and two-step cryoprotectant dilution were 1.94; 11.88 and 6.06%, for EG17, EG22 and EG28 groups, respectively. At the three step dilution, the in vitro survival rates were 4.67; 9.90 and 10.78% for EG17, EG22 and EG28 groups, respectively.

Capacitaçäo espermática in vitro com heparina e cálcio ionóforo e sua correlaçäo com a fertilidade em touros / Evaluation of in vitro sperm capacitation with heparin and calcium ionophore in bulls

O objetivo deste estudo foi avaliar os protocolos de capacitaçäo espermática in vitro com 100 mg/ml de heparina e 5 mM de cálcio ionóforo e correlacionar a capacitaçäo com a fertilidade in vivo. A capacitaçäo espermática foi avaliada pela coloraçäo com iodeto de propídio e diacetato de carboxifluoresceína e pela coloraçäo tripla com vermelho congo, vermelho neutro e giemsa. Os espermatozóides foram avaliados quanto a viabilidade (vivos ou mortos) e a qualidade do acrossomo (lesados ou íntegros), sendo caracterizados como capacitados (vivos e lesados), näo capacitados (vivos e íntegros) e mortos (lesados ou íntegros). A heparina apresentou 64,54 por cento e 39,16 por cento e o cálcio ionóforo 36,41 por cento e 18,11 por cento de espermatozóides capacitados, respectivamente, pela epifluorescência e coloraçäo tripla. Os touros foram divididos em três grupos de fertilidade, sendo o Grupo A <63 por cento, o Grupo B entre 63 e 68 por cento e o Grupo C >68 por cento. Nos três grupos houve diferença significativa (p<0,01) em relaçäo aos espermatozóides capacitados dos tratamentos com heparina e cálcio ionóforo, tanto na epifluorescência quanto na coloraçäo tripla. Näo houve diferença estatística significativa (p>0,01) para os espermatozóides capacitados, näo capacitados e mortos entre os grupos A, B e C, tanto na epifluorescência quanto na coloraçäo tripla para ambos capacitores (heparina e cálcio ionóforo). Näo houve correlaçäo entre os espermatozóides capacitados in vitro e a taxa de fertilidade a campo. A heparina apresentou melhor taxa de espermatozóides capacitados e a epifluorescência mostrou-se mais eficiente na detecçäo da capacitaçäo espermática (p<0,01)

Cryopreservation of mouse morulae through different methods: slow-freezing, vitrification and quick-freezing

The in vitro and in vivo development of mouse morulae after cryopreservation through different methods was examined. The slow-freezing involved an equilibration in 1.5M ethylene glycol (EG) and cooled at 0.5; 0.7; 1.0 or 1.2ºC/minute. The vitrification involved a 3 minutes equilibration in 20 percent EG and 60 seconds in solution containing 40 percent EG, 18 percent ficoll and 10.26 percent sucrose. The quick-freezing involved an equilibration in 3M EG + 0.3M sucrose for 5 minutes and 2 minutes in nitrogen vapor. In all three methods the straws were thawed in air for 10 seconds and in water at 25ºC for 20 seconds and the embryos cultured in vitro for 72 hours to estimate blastocyst rate. To assess viability in vivo, frozen morulae as well as fresh embryos were transferred into recipients. The in vitro development rates with 0.5, 0.7; 1.0 and 1.2ºC/minute were, respectively, 72.3; 79.6; 76.5 and 84.8 percent. There was no significant difference among the cooling rates of 0.7; 1.0 and 1.2ºC/minute (p > 0.01). The in vitro survival rates of vitrification and quick-freezing (84.5 and 74.3 percent, respectively) were similar to the slow-freezing. In vivo, the implantation rate and number of fetuses from embryos frozen through slow-freezing at 1.2ºC/minute, vitrification and quick-freezing were not significantly different

Comparaçäo dos índices reprodutivos com inseminaçäo artificial ou cobertura natural sob influências sazonais em suínos / Comparative reproductive rates using artificial insemination and natural mating under seasonal influences in swine

Os resultados das taxas de fertilidade e dos tamanhos das leitegadas foram analisados na granja de suínos da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de Säo Paulo no Campus de Pirassununga, durante o período de 4 anos (1992 a 1995), com o objetivo de comparar a inseminaçäo artificial (IA) e a cobertura natural (CN) em diferentes épocas do ano, procurando estudar as influências sazonais sobre os índices reprodutivos. Foram avaliadas 799 coberturas em fêmeas das raças Landrace (L), Large White (LW) e mestiças, sendo 539 de IA e 260 de CN. Reprodutores (L e LW) de comprovada fertilidade foram utilizados tanto para CN quanto para IA. As doses de sêmen apresentavam concentraçäo mínima de 3 bilhöes de espermatozóides em volume de 100 ml. As IA foram realizadas às 12 e às 24 horas após reflexo positivo de tolerância ao macho, enquanto as montas foram realizadas no momento e às 24 horas após o diagnóstico do cio. Os índices de fertilidade foram de 72,9 por cento e 75,8 por cento e o número de leitoes nascidos de 12,4 e 12,1, respectivamente, para inseminaçäo artificial e monta natural, näo mostrando diferença significativa. A estaçäo climática influenciou a taxa de pariçäo (71,2 por cento, 81,4 por cento, 76,9 por cento e 66,4 por cento, para veräo, outono, inverno e primavera, respectivamente; p < 0,05), mas näo mostrou efeito sobre o tamanho da leitegada. Näo houve influência do tipo de cobertura (IA ou CN) e da interaçäo entre estaçäo climática e tipo de cobertura sobre as taxas de pariçöes e os tamanhos das leitegadas. As médias de temperatura máxima e mínima se correlacionaram negativamente com a taxa de pariçäo

Comparison of five extenders for canine semen freezing

Semen was collected from six stud dogs to compare five extenders in the semen freezing process. Each ejaculate was divided in five parts and added to tris-fructose-citric acid, glicine, lactose, skim milk and tris-fructose-citrate extenders. The semen was diluted at 37ºC in extenders without glycerol, in the ratio 1:1 and cooled for 60 minutes to reach a 5ºC temperature. Then, extenders with glycerol in the ratio of 2:1 were added to give the final prefreezing concentration of 4 per cent of glycerol. The diluted semen with the cryoprotectant was maintained for a further 60 minutes in refrigeration to equilibrate the spermatozoa in the glycerol and packaged in 0.5 ml plastic straws. The straws were maintained for 30 minutes in vapor, plunged and stored in liquid nitrogen. Sperm morphology was evaluated before and after freezing, whereas progressive motility (per cent) and velocity of forward progression (0-5) were appraised in different periods of the freezing process. The extender tris-fructose-citric acid showed the best post thaw progressive motility and velocity of forward progression compared to the others extenders. Semen freezing increased major sperm morphological abnormalities, regardless of the extender

Superovulaçäo de novilhas da raça Nelore com diferentes doses de FSH/LH e congelaçäo de embriöes pelo método one-step com etilenoglicol / Superovulation of Nelore heifers with different FSH/LH doses and embryo freezing by one-step method with ethylene-glycol

Este trabalho teve como objetivo identificar a dose mais eficiente de FSH/LH (300, 400 e 500 UI) no tratamento superovulatório de novilhas da raça Nelore, assim como avaliar o método one-step no processo de congelaçäo de embriöes. A variaçäo da resposta superovulatória tem sido muito grande, o que explica o interesse de diversos pesquisadores em encontrar novos hormônios, doses e momentos para realizar a estimulaçäo ovariana. Foram empregadas doses de 300 (n = 20), 400 (n = 21) ou 500 UI (n = 21) de FSH/LH, iniciando-se no décimo dia do ciclo estral, em 8 aplicaçöes decrescentes, durante quatro dias consecutivos. Foi aplicado PGF2(subscrito)a concomitante com a quinta subdose de FSH/LH e realizadas duas inseminaçöes artificiais às 12 e às 24 horas após o início dos sintomas de estro. As colheitas dos embriöes foram realizadas 6,5 dias após a primeira inseminaçäo artificial. Pelo exame ultra-sonográfico, avaliaram-se os números de folículos no momento da inseminaçäo artificial (15,12; 15,76; e 14,94) e de corpos lúteos (10,68; 11,55; e 10,81) no dia da colheita, encontrando 5,20; 1,81; e 2,76 embriöes viáveis, respectivamente, para 300 UI, 400 UI e 500 UI de FSH/LH. O grupo de 300 UI de FSH/LH apresentou os melhores resultados em relaçäo aos embriöes viáveis. Dos 106 embriöes congelados pelo método one-step em 1,5 M de etilenoglicol e transferidos pelo método nao-cirúrgico, 8 resultaram em prenhez (7,5 por cento). A dose de 300 UI de FSH/LH apresentou melhor resposta superovulatória em comparaçäo com as de 400 e 500 UI para novilhas da raça Nelore. A transferência de embriöes Bos taurus indicus congelados pelo método one-step em 1,5 M de etilenoglicol nao foi eficiente

Influence of the development phase of the dominant follicle on the superovulatory response in Nelore heifers

The aim of this study was to evaluate the influence of the dominant follicle during it's growing, static and regression phases on the superovulatory response in 18 estral cycles of nelore heifers. The follicular development was monitored by ultrasound from Day 6 to Day 10 (Day 0=estrus) of the oestrus cycle, when the diameter of the largest follicle was measured and the number of subordinate follicles counted. The animals where superovulated with 400 or 500IU of FSH/LH twice daily for 4 days begining on day 10 of the oestrus cycle I was injected PGF2(subscribe)a concomitantly with the fifth dose of FSH/LH. Artificial insemination was done 12 and 24 hours after the begining of the estrus. Embryos were recovered on day 6.5 after the first insemination. If a dominant follicle was present before superovulation, it was observed subordinate follicles atretic and low response to superovulatory treatment. The best result of transferable and total embryos was observed when the dominant follicle was in regression phase (3.67 and 10.17) at the beginning of the superovulatory treatment

Co-cultivo de zigotos e embriöes de duas células de camundongos (Mus musculus domesticus) em suspensäo de células epiteliais de ovidutos de camundongos e bovinos nos meios CZB sem glicose, TCM199 e Ménézo B2(subscrito) / Zygotes and two cells mouse embryos in co-culture of mouse and bovine epithelial cells in CZB glucose free, TCM199 and Ménézo B2(subscribe) mediuns

Zigotos e embriöes de 2 células de camundongos F1 (C57/DBA) foram cultivados (controle) e co-cultivados em suspensöes de células epiteliais de ovidutos de camundongos (MOEC) e de bovinos (BOEC) até o estádio de blastocistos nos meios CZB, TCM199 e Ménézo B2(subscrito). Os zigotos que atingiram os estádios de blastocistos expandido e eclodido no CZB foram 44 (38,26 por cento) para o controle, 2 (1,89 por cento) para as MOEC e 8 (6,72 por cento) para as BOEC, sendo que o controle apresentou-se estatisticamente diferente (p(menor ou igual)0,05) em relaçäo às MOEC e às BOEC. Os zigotos cultivados e co-cultivados nos meios TCM199 e B2(subscrito) näo clivaram além de 2 células. Os embriöes de 2 células que desenvolveram até blastocistos no CZB foram 46 (43,80 por cento) para o controle, 45 (38,79 por cento) para as MOEC e 37 (29,60 por cento) para as BOEC, sendo que o controle apresentou-se estatisticamente diferente (p(menor ou igual)0,05) em relaçäo às BOEC. No TCM199, o total de blastocistos foi de 52 (48,15 por cento) para o controle, 68 (39,08 por cento) para as MOEC e 64 (48,49 por cento) para as BOEC, näo havendo diferença estatística (p>0,05) entre os três grupos. No B2(subscrito), o total de blastocistos foi de 28 (24,78 por cento) para o controle, 34 (28,10 por cento) para as MOEC e 25 (23,81 por cento) para as BOEC, näo havendo diferença estatística (p>0,05) entre os três grupos. Concluiu-se que o bloqueio dos zigotos nos meios TCM199 e B2 pode estar relacionado à presença da glicose e que o oviduto nao é espécie-específico quanto a sua capacidade em promover o desenvolvimento de embriöes de camundongos