Seroprevalencia de la Leishmaniasis Visceral Canina mediante Elisa con rK39 en Focos Endémicos de Venezuela / Seroprevalence of Canine Visceral Leishmaniasis by rK39-ELISA in Endemic Foci in Venezuela

En el presente trabajo se presenta la seroprevalencia de la leishmaniasis visceral canina (LVC), zoonosis causada por Leishmania infantum/chagasi. Se realizaron pruebas serológicas y examen clínico a 15.822 perros de 13 entidades federales endémicas para la leishmaniasis visceral en Venezuela, en el periodo 2004-2012. Los sueros fueron analizados mediante ELISA con el antígeno recombinante rK39. Los resultados muestran que 14,8% de la población de caninos son positivos para LV. Los estados Lara (19%) y Guárico (18%) mostraron una mayor prevalencia de la enfermedad. Sin embargo, para los años 2010-2012, la prevalencia de la LVC para las entidades federales como Anzoátegui, Aragua, Carabobo, Cojedes, Nueva Esparta y Sucre se mantuvieron entre un 3% y un 31%. Los caninos seropositivos (67,1% machos y 32,9% hembras) tenían edades promedio de 4,8±2,9 años. El 81% de los caninos seropositivos encontrados en estas zonas, no presentó signos clínicos característicos de LVC, mientras que la clínica presentada por el resto fueron ulceraciones cutáneas (8,5%), alopecia (9,4%) y onicogrifosis (19,2%). Este reporte muestra la distribución geográfica (tanto en zonas rurales como urbanas) y características clínicas más resaltantes de perros parasitados en las diferentes regiones endémicas del país, con el fin de tomar medidas estratégicas que fortalezcan los programas de control y prevención de esta zoonosis problema de salud pública.

This study discloses the seroprevalence of canine visceral leishmaniasis (CVL), a zoonotic disease caused by Leishmania infantum/chagasi. In this study, serological tests and clinical examinations were performed in 15,822 dogs from 13 federal entities endemic for visceral leishmaniasis in Venezuela, during the period 2004-2012. Serum samples were analysed by ELISA against the recombinant antigen rK39. Results demonstrated a prevalence of 14.8% of positive dogs for VL. Lara (19%) and Guárico (18%) states showed the highest seroprevalence of the disease. However, for the years 2010-2012, the prevalence of CVL for federal entities as Anzoátegui, Aragua, Carabobo, Cojedes, Nueva Esparta, and Sucre remained between 3% and 31%. The seropositive canines (67.1% males and 32.9% females) average 4.8±2.9 years of age and 81% of the dogs found in these endemic areas did not show clinical signs characteristic of LVC, while clinical symptoms presented by the rest were skin ulceration (8.5%), alopecia (9.4%) and onychogryphosis (19.2%). This report demonstrates the geographical distribution (both rural and urban) and most striking clinical features of parasitized dogs in different endemic regions of the country, in order to take strategic actions to strengthen the control and prevention programs of this public health problem.

Citocinas reguladoras (IL-10 y TGF-B) en pacientes con leishmaniasis cutánea Americana / Regulatory cytokines (IL-10 and TGF-B) in American cutaneous leishmaniasis patients

La leishmaniasis cutánea Americana (LCA) presenta un espectro clínico e inmunológico, donde las formas intermedias se asocian con respuestas celulares exacerbadas frente a Leishmania spp., que pueden reflejar defectos de inmunoregulación. Debido a que la IL-10 y el TGF-β son algunos de los factores importantes en modular la respuesta inmunitaria, nos propusimos establecer si existen alteraciones en su producción entre las diferentes manifestaciones de la leishmaniasis cutánea. Se estudiaron individuos con leishmaniasis cutánea: localizada (LCL n=20), mucocutánea (LCM n=14), intermedia (LCI n=20), difusa (LCD n=12) y 22 voluntarios sanos. La IL-10 se determino por citometría de flujo y el TGF-β por ELISA en muestras de plasma y en sobrenadantes de cultivos linfocitarios de pacientes y controles, estimulados "in vitro" con L. braziliensis. Se evidenció una baja producción de IL-10 en los pacientes con LCI respecto a los LCM y LCD. Mientras que en plasma, no se observaron variaciones en la concentración de esta citocina entre los diferentes grupos. En contraste, el TGF-β estuvo incrementado significativamente en concentración y frecuencia de individuos respondedores en todos los grupos de pacientes respecto a los controles, siendo más elevado en los pacientes LCM asociado con un Odds Ratio muy elevado (87). Luego de estimulación con L. braziliensis, los pacientes con LCM continúan mostrando una mayor producción de TGF-β que los pacientes con LCI y LCD. En general, nuestros resultados sugieren que la IL-10 y el TGF-β pudiesen estar mediando supresión en los pacientes con LCD y una inadecuada inmunoregulación en los pacientes con LCI por el escaso nivel de estas. En los pacientes LCM, ambas citocinas fallan en modular la respuesta exacerbada presente en ellos. Otros mecanismos de regulación deben de ser investigados en futuros estudios.

American cutaneous Leishmaniasis shows a clinical and immunological spectrum, where intermediate forms are associated with exacerbated cell responses against Leishmania spp., which may reflect defective immunoregulation. Since IL-10 and TGF-β modulate the immune response, we aimed to establish whether there are changes in its production between the different manifestations of cutaneous leishmaniasis. We studied individuals with cutaneous leishmaniasis: localized (LCL n = 20), mucocutaneous (MCL n = 14), intermediate (ICL n = 14), diffuse (LCD n = 12) and twenty two healthy subjects. The IL-10 was determined by flow cytometry and TGF-β by ELISA in plasma and in supernatants of lymphocyte cultures from patients and controls stimulated in vitro with L. braziliensis. The results showed a low production of IL-10 in patients with intermediate or chronic leishmaniasis compared to MCL and DCL patients. There were no changes in plasma concentration of this cytokine among the different groups. In contrast, the TGF-ß was significantly increased in concentration and frequency of respondents in all groups of patients compared to controls, being higher in MCL patients associated with an elevated odds ratio (87). After stimulation with L. braziliensis, the MCL patients continue to show increased production of TGF-β compared to ICL and LCD patients. Overall, our results suggest that IL-10 and TGF-β could be mediating suppression in DCL patients and an inadequate or defective regulation in ICL patients by the low level of these cytokines. In MCL patients, both cytokines fail to modulate their exacerbated response. Other regulatory mechanisms must be investigated in future studies.

Estandarización de la prueba aglutinación directa empleando antígenos autóctonos para el diagnóstico de la leishmaniasis visceral en zonas endémicas de Venezuela / Standardization of direct agglutination test using native antigens for diagnosis of visceral leishmaniasis endemic areas of Venezuela

La leishmaniasis visceral es la manifestación clínica más severa de la leishmaniasis ya que puede ser fatal si no se administra el tratamiento adecuado. En Venezuela el foco mas activo es la isla de Margarita, donde principalmente se ven afectados niños de 0 a 9 años. De ahí la importancia de un diagnostico temprano, a menudo difícil en las áreas endémicas. Si bien la prueba de oro para el diagnostico de leishmaniasis visceral es la detección directa de los parásitos, la toma de muestra es bastante invasiva e incomoda para el paciente. Más aún, la mayoría de estas técnicas son costosas, complejas y de larga ejecución. Otros métodos indirectos, como la ELISA (usando antígenos crudos o definidos del parásito) requieren de equipos y personal especializados; lo cual es difícil de cubrir en las zonas endémicas. Recientemente validamos en Venezuela, el uso de una técnica de aglutinación directa (KIT Biomedical Research) evidenciándose una elevada sensibilidad y especificidad. El antígeno empleado en esta prueba es Leishmania donovani. Sin embargo, en nuestro país el agente causal de esta parasitosis es Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi). Otro aspecto a considerar es la variación antigénica regional que sufre un parásito al interactuar con el vector local y con factores del hospedero; además del costo; por lo tanto desarrollamos una prueba de aglutinación directa un antígeno de L. infantum (syn. L. chagasi) obtenido de perros de la isla de Margarita. Éste se comparó con la prueba comercial, ensayando sueros de pacientes de leishmaniasis visceral confirmados y controles. Empleando como patrón de oro el ELISA con rK39, obtuvimos en ambos una sensibilidad del 100%; y una especificidad del 82,85 % para la prueba comercial y 98,78% para el nuestro, lo cual pone en manifiesto la relación específica entre los anticuerpos de pacientes venezolanos y el antígeno predominante del país

Visceral leishmaniasis is the most severe form of leishmaniasis, and it is deadly if left untreated. Margarita Island is the most active visceral leishmaniasis focus in Venezuela, where most of the affected population are children between 0 to 9 years old. Therefore, an early diagnosis is very important, unfortunately, this is difficult in endemic areas. Although, the gold standard method for visceral leishmaniasis diagnosis is parasite detection; the sample retrieval is very inconvenient for patients. Moreover, most techniques are time-consuming, expensive and difficult to carry out. Other indirect methods, such as ELISA (using crude or define Leishmania antigens), require specialised technicians and equipment, which is unsuitable in the field areas.Recently we validated the performance of a direct agglutination test for the diagnosis of visceral leishmaniasis in Venezuela (KIT Biomedical Research). It showed elevated sensitivity and specificity. Nevertheless, this test includes Leishmania donovani as antigen, whereas visceral leishmaniasis in our country is caused by Leishmania infantum (= L. chagasi). Moreover, parasite antigenic variation as a result of vector-parasite and host-parasite interaction is an important factor to be considered; in addition to the costs. Therefore, we developed a direct agglutination test using L. infantum (syn. L. chagasi) isolated from a naturally infected dog of Margarita Island. This was compared to the available commercial kit, and testing confirmed visceral leishmaniasis patients and healthy controls. Using rK39 ELISA as gold standard, it was found 100% sensitivity for both tests, and 82.85 % specificity for the commercial test and 98.78% for the local one, which shows the relationship between dominant local antigens and antibody’s specificity displayed by Venezuelan patients