Optimización en la recuperación de inmunoglobulinas, como molécula entera y fragmento F(ab´)2, en la producción de antivenenos / Optimization in the immunoglobulins recovery, as whole molecule and F(ab´)2 fragment, in the antivenim production

En la actualidad se utilizan, principalmente, dos métodos de purificación de anticuerpos a partir de plasmas equinos hiperinmunes para la producción de antivenenos a nivel industrial, obteniéndose preparaciones enriquecidas en moléculas de inmunoglobulinas G ó fragmentos F(ab´)2. Con ambos métodos, luego de la precipitación, se observa una importante pérdida de capacidad neutralizante en comparación con la capacidad neutralizante de los plasmas de partida. En este trabajo, se realizó el fraccionamiento de plasmas equinos hiperinmunes utilizando ácido caprílico con y sin digestión enzimática con pepsina. El objetivo del trabajo fue dar a conocer la proporción de recuperación de la capacidad neutralizante luego del fraccionamiento; resultando ésta menor cuando el plasma se trató enzimáticamente. Adicionalmente, se propuso establecer cuál sería la etapa responsable de la diferencia en la recuperación de anticuerpos entre una metodología y otra. Cuando se purificaron las inmunoglobulinas enteras, se recuperó aproximadamente un 53% de la capacidad neutralizante mientras que cuando la muestra se purificó luego de ser tratada enzimáticamente, se obtuvo alrededor del 30% de esa actividad. Una relación de similar magnitud se verifica en la recuperación de la masa de proteínas solubles luego de remover los contaminantes, entre una metodología y otra. La insolubilización del fragmento Fc generado durante la digestión sería el responsable de esa pérdida adicional de proteína y capacidad neutralizante.

Today two methods are mainly used for the purification of antibodies from hyperimmune equine plasma at industrial level obtaining enriched preparations of immunoglobulin G (IgG) molecules or F(ab´)2 fragments. In both methods, after the precipitation, an important loss in the neutralizing capability was observed compared to the one of the original plasma. In this work, we performed the fractionation of hyperimmune equine plasma using caprylic acid, with and without enzymatic digestion with pepsin. The aim was to explain the percentage of recovery of the neutralizing capability after the fractionation; which resulted minor when the plasma was enzymatically treated. Additionally, we intended to establish which stage, in the purification process, was the responsible for the difference in the antibody recovery between one methodology and the other. When entire immunoglobulins were purified, approximately 53% of the neutralizing capacity was recovered, but when the sample was purified after the enzymatic treatment, around the 30% of the activity was obtained. A ratio of similar magnitude is verified on the recovery of the soluble protein mass after the removal of contaminants, between the two methods. The insolubilization of the fragment Fc generated during digestion would be responsible for the additional loss of protein and neutralizing capacity.

Comparación entre dos métodos de producción para la elaboración de antivenenos ofídicos / Snake antivenin: Comparison between two production methods

Las mordeduras producidas por serpientes venenosas son un serio problema médico en varias regiones del mundo y sobre las cuales los sistemas de salud actúan en diferentes grados en lo referente a tratamiento y prevención. Sin embargo, el tratamiento de las mordeduras de serpientes venenosas en animales domésticos puede resultar difícil por diversos motivos, siendo uno de estos la baja oferta o ausencia de antivenenos para uso veterinario. Las presiones comerciales en la industria farmacéutica han llevado a una reducción en la producción de antivenenos en varias partes del mundo, su disponibilidad es, a veces, bastante limitada y en algunos casos, son imposibles de conseguir. En este trabajo, inmunizamos caballos con veneno de serpientes Sudamericanas para obtener el plasma hiperinmune que fue procesado para obtener IgG entera o fragmentos F(ab´)2 usando dos métodos convencionales (fraccionamiento por ácido caprílico o doble precipitación salina y digestión con pepsina). Los antivenenos así obtenidos fueron probados en sus características bioquímicas e inmunoquímicas, así como en su potencia neutralizante. El SDS-PAGE de los antivenenos mostró bandas en el orden de los 150 y 100 kDa en los antivenenos conteniendo IgG entera o fragmentos F(ab´)2, respectivamente. La presencia de albúmina o contaminantes de alto o bajo peso molecular no fue detectada en ninguna de las preparaciones. No se observaron diferencias importantes en la potencia neutralizante de los antivenenos, aunque el costo de producción fue mucho más bajo en la obtención de IgG completa. A partir de esto, se sugiere que los bajos costos de producción en la obtención de antivenenos de IgG entera para uso veterinario, hacen a esta tecnología adecuada y rentable cuando la producción de F(ab´)2 no es posible.

Bites by venomous snakes are a serious medical problem in several regions of the world, on which the different health systems act with different modalities. Nevertheless, the treatment of venomous snakebites in domestic animals can turn difficult due several problems among which, the conspicuous, is the low availability or lack of antivenoms for veterinary use. As commercial pressures on the pharmaceutical industry have led to a reduction in the production of antivenins in several parts of the world, their availability is sometimes rather limited and sometimes these products are impossible to obtain. In this work, we immunized horses with venom of South American vipers to obtain hyperimmune plasma. The plasma was processed to separate whole IgG of F(ab´)2 fragments using two conventional methods (caprylic acid fractionation or double saline precipitation and pepsin digestion). The obtained antivenins were tested for their biochemical and immunochemical characteristics and neutralizing potency. The SDS-PAGE of the antivenins showed, in the processed antivenin, bands in the order of 150 and 100 kDa in the whole IgG or F(ab´)2 fragments, respectively. The presence of albumin or contaminants of high or low molecular weight was not detected in any of the preparations. No important differences were observed in the neutralizing potency of the antivenins, although production cost was very low with the method used to obtain pure IgG. The low production cost makes the production of antivenins for veterinary use profitable when the production of F(ab´)2 fragments is not possible.

Toxicidad de venenos de serpientes de importancia médica en México / Toxicity of venoms from snakes of medical importance in Mexico

La caracterización de las actividades tóxicas de los venenos de serpientes es necesaria para el cabal entendimiento de los procesos fisiopatológicos que se producen ante su mordedura, como también para evaluar la potencia neutralizante de los antivenenos utilizados para tratar estos envenenamientos. A causa de los pocos datos disponibles sobre la toxicidad del veneno de serpientes con importancia sanitaria en México, estudiamos las actividades tóxicas de los venenos de Bothrops asper, Athropoides nummifer, Agkistrodon billineatus> Crotalus durissus durissus, Crotalus basiliscus, Crotalus scutulatus, Crotalus atrox y Micrurus nigrocinctus. A los venenos se les realizaron los siguientes estudios: SDS-PAUE, determinación de la potencia letal, y de las actividades hemorrágica, necrotizante, coagulante en plasma y fibrinógeno, fosfolipásica y fibrinogenolítica. Se estudió además la capacidad neutralizante de un antiveneno de uso corriente para la terapéutica de las mordeduras de serpientes venenosas en México, sobre varias de estas actividades. Los venenos de vipéridos mostraron actividades hemorrágicas, necrotizante, coagulante sobre plasma, protrombínica, fibrinogenolítica y fosfolipásica importantes. Los venenos de mayor potencia letal fueron los de Micrurus nigrocinctus y Crotalus scutulatus, sin embargo el veneno que presentó en general potencias tóxicas mayores fue el de Bothrops asper. Las diferentes potencias tóxicas halladas se encontraron dentro de los márgenes descritos para especies de vipéridos y elápidos de Sudamérica. La actividad sobre el plasma y el fibrinógeno fue muy diferente en los diferentes venenos viperinos, sin embargo todos mostraron ser capaces de afectar componentes del sistema de la coagulación. El antiveneno probado no sólo neutralizó la letalidad del veneno sino también sus actividades tóxicas.

The characterization of the toxic activities of snake venoms is necessary to understand the physiopathology of the envenomation and to test the potency of the antivenoms used to treat this pathology. Because of the lack of data on the toxic activities of venoms from Mexican snakes of medical importance, we studied the venoms from Bothrops asper, Athropoides nummifer, Agkistrodon billineatus, Crotalus durissus durissus, Crotalus basiliscus, Crotalus scutulatus, Crotalus atrox and Micrurus nigrocinctus. The studies performed were : SDS-PAOE, determination of lethal potency, hemorrhagic, necrotizing, coagulation on plasma and fibrinogen, phospholipasic and fibrinogenolytic activities. In addition we studied the neutralizing capacity of the toxic activities of an antivenom currently used for the treatment of snakebites in Mexico. The venom from viperids showed important hemorrhagic, necrotizing, coagulative on plasma, prothrombinic, fibrinogenolytic and phospholipase activities. The venoms with the highest lethal potency were those of Micrurus nigrocinctus and Crotalus scutulatus; however, the viperine venom that globally displayed the most potent toxic activities was from Bothrops asper. All the venoms showed toxic activities of similar range to those described for other American venomous snakes. The activity on plasma or fibrinogen varied widely among the different venoms but all displayed capacity to act on the coagulation system. The antivenom tested not only neutralized the lethalityB. asper venom but also its other toxic activities.

Neutralizacion cruzada de veneno de bothrops jararacussu por sueros antiofidicos heterologo / Cross neutralization of bothrops jararacussu venom by heterologous antivenoms

En la Argentina se utilizan tres tipos de sueros antiofídicos frete a la mordedura de crotálidos, el Anticrotálico Monovalente, contra el veneno de Crotalus durissus terrifucus ("víbora de cascabel"), el Botrópico Bivalente y el Botrópico Tetravalente ("Misiones") contra los venenos de las diferentes especies de Bothrops que se encuentran en la Argentina (las diferentes "y"rará")" Además, existe un suero Botrópico-Crotálico (Trivalente) el cual cubriria el mismo espectro que el Bivalente más el Anticrotálico. En este trabajo estudiamos la reactividad inmunoquímica de los sueros antibotrópicos Bivalente y Tetravalente, del Botrópico Crotálico (Trivalente) y del Anticrotálico Monovalente con el veneno de Bothrops jararacussu ("yararacuzú", "tapete dourado"). Además, se estudió la capacidad neutralizante de estos antivenenos sobre la potencia letal, y las actividades hemorrágica, necrotizante, procoagulante y hemolítica indirecta del veneno de B. jararacussu. La potencia neutralizante sobre las actividades biológicas y tóxicas de este veneno por todos los antivenenos utilizados es similar a la obtenida con el suero antibotrópico tetravalente (homólogo). Estos resultados sugieren la posibilidad de emplear sueros antibotrópicos heterólogos en el tratamiento de los accidentes por B. jararacussu.