HIGH SENSITIVE PCR METHOD FOR DETECTION OF PATHOGENIC Leptospira spp. IN PARAFFIN-EMBEDDED TISSUES / PCR altamente sensible para la detección de Leptospira spp. patógenas en tejidos embebidos en parafina

This study describes the development and application of a new PCR assay for the specific detection of pathogenic leptospires and its comparison with a previously reported PCR protocol. New primers were designed for PCR optimization and evaluation in artificially-infected paraffin-embedded tissues. PCR was then applied to post-mortem, paraffin-embedded samples, followed by amplicon sequencing. The PCR was more efficient than the reported protocol, allowing the amplification of expected DNA fragment from the artificially infected samples and from 44% of the post-mortem samples. The sequences of PCR amplicons from different patients showed >99% homology with pathogenic leptospires DNA sequences. The applicability of a highly sensitive and specific tool to screen histological specimens for the detection of pathogenic Leptospira spp. would facilitate a better assessment of the prevalence and epidemiology of leptospirosis, which constitutes a health problem in many countries.

El presente estudio describe el desarrollo y aplicación de un nuevo ensayo de PCR para la detección específica de leptospiras patógenas y su comparación con un protocolo reportado previamente. Se diseñaron nuevos cebadores para la optimización y evaluación de la PCR en tejidos embebidos en parafina infectados artificialmente. La PCR se aplicó además a muestras de tejidos embebidos en parafina y se realizó la secuenciación del amplicón resultante. La PCR diseñada fue más eficiente que el protocolo reportado, permitiendo la amplificación del fragmento de ADN esperado en las muestras infectadas artificialmente y del 44% de las muestras post mortem. Se secuenciaron 10 amplicones provenientes de pacientes diferentes. La aplicabilidad de una herramienta altamente sensible y específica en la búsqueda de leptospiras patógenas en especímenes histopatológicos podría facilitar una mejor valoración de la prevalencia y la epidemiología de la leptospirosis, la que constituye un problema de salud en disímiles países.

An Alternative and Rapid Method for the Extraction of Nucleic Acids from Ixodid Ticks by Potassium Acetate Procedure

Four variants of the potassium acetate procedure for DNA extraction from ixodid ticks at different stage of their life cycles were evaluated and compared with phenol-chloroform and ammonium hydroxide methods. The most rapid and most efficient variant was validated in the DNA extraction procedure from the engorged ticks collected from bovine, canine as well as from house ticks for the screening of Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma spp. and Babesia spp. The ammonium hydroxide procedure was used for non-engorged ticks. All the variants were efficient and allowed obtaining PCR-quality material according to the specific amplification of 16S rRNA gene fragment of the original tick. DNA extracted from the ticks under the study was tested by multiplex PCR for the screening of tick-borne pathogens. Anaplasma spp. and Babesia spp. amplification products were obtained from 29/48 extracts. Ammonium hydroxide protocol was not efficient for two extracts. Detection of amplification products from the PCR indicated that DNA had been successfully extracted. The potassium acetate procedure could be an alternative, rapid, and reliable method for DNA extraction from the ixodid ticks, mainly for poorly-resourced laboratories.

Detection of leptospires from infected urine and tissue samples in vitro by modified Fontana silver stain / Detecção de leptospiras na urina e nos tecidos infectados in vitro por impregnação com prata Fontana modificada

INTRODUCTION: The microbiological diagnosis of leptospirosis comprises bacteriological and serological methods. The former ones allow the direct detection of leptospires and are considered presumptive with the exception of culture. Therefore, they constitute invaluable tools for rapid diagnosis, mainly in samples from deceased subjects. OBJECTIVE: To evaluate a modified Fontana silver staining method in experimentally infected samples. MATERIAL AND METHODS: Human and animal (hamster) urine samples were experimentally infected with different strains of Leptospira interrogans sensu lato. Liquid culture medium, leptospira cultures, experimentally infected and non-infected human urine samples, clarified and non-clarified imprints, and clarified and non-clarified suspension smears from tissues of experimentally infected and non-infected hamsters were applied for the ass essment of silver staining. The analytical sensitivity of the assay was compared with dark field microscopy and culture. Other bacterial and fungi species were also used. RESULTS: The modified Fontana silver staining allowed the accurate observation of the well-defined leptospire helical structure. On leptospire cultures from infected human samples, we could observe until (1-10) × 10³ leptospires/ml, higher sensitivity in comparison with direct dark field microscopy and lower in comparison with culture. The best results in tissues were obtained on clarified imprints and non-clarified suspension smears. Morphological and stainable structures compatible with leptospires were not observed in the samples without them. CONCLUSION: This procedure allowed differentiating the characteristic morphology of leptospires. As its application suggests, it consists of a simple and easily conducted procedure with stable reagents.

INTRODUÇÃO: O diagnóstico microbiológico da leptospirose inclui métodos bacteriológicos e sorológicos; os primeiros permitem a detecção direta de leptospiras e, à exceção do cultivo, são considerados como presuntivos, mas constituem ferramentas valiosas para o diagnóstico rápido, principalmente nos falecidos. OBJETIVO: Avaliar a coloração de prata Fontana modificada em amostras experimentalmente infectadas. MATERIAL E MÉTODOS: Urinas humanas e hamsters foram infectados experimentalmente com diferentes cepas de Leptospira interrogans sensu lato. Para a avaliação, foi utilizado meio de cultura líquido, culturas de leptospiras, urinas humanas experimentalmente infectadas e não infectadas, impressões clarificadas e não clarificadas e esfregaços de suspensões clarificadas e não clarificadas a partir de tecidos de hamsters infectados e não infectados para o experimento. A sensibilidade analítica do ensaio foi comparada com a microscopia de campo escuro e de cultura. Outras espécies de bactérias e fungos também foram utilizadas. RESULTADOS: A coloração de prata de Fontana modificada permitiu observar claramente e bem definida a estrutura helicoidal das leptospiras. Nas culturas destas e de urinas humanas infectadas, pôde-se observar até (1-10) × 10³ leptospiras/ml, sensibilidade superior à da microscopia de campo escuro e inferior à da cultura. Os melhores resultados nos tecidos foram obtidos em impressões clarificadas e a partir de esfregaços de suspensões não clarificadas. Estruturas morfológicas e tingidas compatíveis com leptospiras não foram observadas nas amostras livres destas. CONCLUSÃO: Esse procedimento permitiu diferenciar a morfologia característica das leptospiras. É um procedimento simples, fácil de realizar e com reagentes estáveis pelo o que a sua aplicação é sugerida.

Prevalence of antibodies to Borrelia burgdorferi sensu stricto in humans from a Cuban village

Lyme disease has not been officially reported in Cuba. However, clinical cases have been serologically reported. Seroprevalence survey of Borrelia burgdorferi sensu stricto antibodies in humans in the country has not been conducted. OBJECTIVE: To estimate the prevalence of borrelial antibodies in inhabitants of a village with historically high level of tick infestation. METHODS: Serum specimens from 247 persons randomly selected from the population of the village were examined by IgG Western blot using B31 strain for estimating the prevalence of antibodies profile. RESULTS: A seroprevalence value interval (95 percent CI) of 0.6 percent-7.2 percent was estimated for the studied population. The prevalent borrelial protein bands on immunoblots were 41, 72, 90/93, 34, 47, 60, 58, 56, 65/66 and 31 kDa in a decreasing order of significance. CONCLUSION: These results support the previous serological findings, suggesting the presence of this borreliosis in Cuba.

Detección molecular de patógenos emergentes de importancia médica y veterinaria en garrapatas capturadas sobre caballos domésticos / Molecular detection of emerging pathogens of medical and veterinary importance in ticks found in domestic horses

En la actualidad son varias las especies de patógenos emergentes de importancia médica y veterinaria transmitidos por garrapatas. Los estudios sobre estos agentes y sus enfermedades han sido escasos en Cuba. Conocer la presencia de algunos de estos patógenos en garrapatas cubanas que afectan el ganado equino. Se procesaron 95 garrapatas colectadas de caballos domésticos, conservadas en alcohol e identificadas taxonómicamente según claves convencionales. A cada una se le realizó extracción de ADN y posteriormente diferentes reacciones en cadena de la polimerasa utilizando cebadores específicos para los grupos microbianos Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma-Ehrlichia, y Babesia-Theileria. Cada uno de los productos de las reacciones en cadena de la polimerasa fue sometido a hibridaciones en línea reversa utilizando sondas para cada grupo en cuestión, así como específicas para las principales especies de estos. Las garrapatas estudiadas pertenecían a las especies Dermacentor (Anocentor) nitens (60 por ciento), Amblyomma cajennense (38 por ciento) y Rhipicephalus (Boophilus) microplus (2 por ciento). Se detectaron 7 garrapatas Dermacentor (Anocentor) nitens infectadas con bacterias del grupo Anaplasma/Ehrlichia, y no se pudo identificar la especie en cuestión con las sondas utilizadas. Una de estas garrapatas estaba además coinfectada con Babesia bovis. Se sugiere la circulación de una nueva especie de Anaplasma o Ehrlichia no reportada antes en Cuba, por lo que se necesita estudiar un número mayor de garrapatas, así como la incorporación de nuevas sondas en la hibridación en línea reversa u otras metodologías que permitan conocer con exactitud las especies que pudiesen afectar hoy día los caballos domésticos.

At present, there are several tick-borne emerging pathogen species of medical and veterinary importance. Few studies on these agents and its diseases have been made in Cuba. To determine the presence of some of these pathogens in Cuban ticks existing in the equine cattle. Ninety five ticks collected from domestic use horses were processed, preserved in alcohol and taxonomically identified according to the set classifications. Their DNA was extracted and subjected to several polymerase chain reactions with specific primers for microbial groups Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma-Ehrlichia, y Babesia-Theileria. Each of the products from polymerase chain reactions underwent reverse line blot hybridation using probes for each group as well as specific probes for the main species included in these groups. The studied ticks belonged to Dermacentor (Anocentor) nitens (60 percent), Amblyomma cajennense (38 percent) y Rhipicephalus (Boophilus) microplus (2 percent). Seven Dermacentor (Anocentor) nitens ticks infested with Anaplasma/Ehrlichia bacteria were detected but the species in question could not be detected by the used probes. One of these ticks was also co-infested with Babesia bovis. It is suggested that a new species of Anaplasma o Ehrlichia, not reported in Cuba before now, is circulating, so studying a higher number of ticks is needed and new probes in reverse line blot hybridation or other methodologies must be incorporated to allow exactly determining the species that may affect the Cuban domestic horses at present.

Evaluation of a modified culture medium for Borrelia burgdorferi sensu lato

The aim of the present study was to assess the possible use of a modified medium, prepared in the laboratory using the constituents of Barbour-Stonner-Kelly (BSK) medium and medium 199 as base, for the culture of Borrelia strains, comparing the growth of individual strains in this medium and in the BSK-H medium, and the protein profile and antigenic characteristics of Borrelia proteins expressed in these media. A qualitative evaluation of growth of Borrelia species was made with acceptable results (morphology and motility), but during a quantitative evaluation using the three main genospecies of Borrelia, the better results were obtained with a B. burgdorferi sensu stricto strain. The modified medium did not enable the growth of a B. afzelii strain. The protein profile and antigenic characteristic of the expressed proteins in the modified medium were studied with satisfactory results. These results suggest the modified medium as an alternative for the cultivation of Borrelia strains, with some limitations, in poorly-resourced laboratories.

Método de la reacción en cadena de la polimerasa en la detección temprana de Leptospira spp. en hemocultivos de pacientes con sospecha de leptospirosis / PCR method for the early detection of Leptospira spp. in hemocultures from patients suspected of leptospirosis

Se aplicó un método de la reacción en cadena de la polimerasa para la detección temprana de Leptospiras spp. en hemocultivos procedentes de pacientes con sospecha de leptospirosis humana. Los métodos moleculares, y en particular la amplificación del ADN por la reacción en cadena de la polimerasa y sus variantes, constituyen herramientas muy útiles y específicas, utilizadas en la actualidad con esta finalidad. Se lograron identificar por la reacción en cadena de la polimerasa Leptospiras spp. en 41,3 por ciento (33/80) de los hemocultivos a los 7 d de incubación, los que también se clasificaron como positivos por los métodos convencionales. Sin embargo, hubo 20 por ciento (16/80) en los que también por este método se lograron identificar Leptospiras spp., pero por los métodos convencionales resultaron ser negativos. De los hemocultivos 38,7 por ciento (31/80) resultó negativo tanto por la reacción en cadena de la polimerasa como por los métodos convencionales. El uso del método de la reacción en cadena de la polimerasa a partir de hemocultivos, es una alternativa valiosa para la detección temprana y el diagnóstico rápido de Leptospiras spp.

The PCR method for the early detection of Leptospiras spp. in hemocultures from patients suspected of human leptospiros was applied. Molecular methods and, particularly, the amplification of DNA by PCR, and its variants, are very useful and specific tools used nowdays to this end. Leptospiras spp. were identied by means of PCR in 41.3 percent(33/80) of the hemocultures at 7 days of incubation.They were also classified as positive by the conventional methods. However, it was also possible to identify Leptospiras spp. in 20 percent (16/80) by this method, but they proved to be negative by the conventional methods. Of the hemocultures, 38.7 percent (31/80) yielded negative by PCR and by the conventional methods. The use of PCR starting from hemocultures is a valuable alternative for the early detection and rapid diagnosis of Leptospiras spp

The application of monoclonal antibody methodology as a tool for serotyping leptospira isolates in Cuba

By using the monoclonal antibodies methodology we have classified Cuban serovars of leptospires isolated from blood culture of confirmed leptospirosis patients. The serogroups Pomona and Canicola were the most predominant found in our study. Pomona, Mozdok and Canicola serovars were the most prevalent types in these serogroups. Our study has essentially presented a validation of a monoclonal antibody method for the serotyping of Cuban leptospire isolates.

Se clasificaron, mediante la metodología de los anticuerpos monoclonales, los serovares cubanos de Leptospira aislados en hemocultivos de pacientes con leptospirosis confirmada. Los serogrupos Pomona y Canicola fueron los predominantes. Los serovares Pomona, Mozdok y Canicola resultaron los mßs frecuentes dentro de esos serogrupos. Se presentó la validación del método de anticuerpos monoclonales para la tipificación serológica de las leptopiras aisladas en Cuba.

Avances de laboratorio en el diagnóstico serológico y la investigación de la leptospirosis humana en Cuba / Laboratory advances in serologic diagnosis and research of human leptospirosis in Cuba

Se evaluaron por vez primera en Cuba las tecnologías serológicas rápidas para realizar la pesquisa y confirmación de la leptospirosis humana, que mundialmente estßn disponibles. Su reconocimiento clínico resulta difícil, el diagnóstico etiológico rápido es de vital importancia Se obtuvieron valores de sensibilidad y especificidad superiores a 90 por ciento en los sistemas confirmatorios y de 85 por ciento en el de pesquisa. De los pacientes graves estudiados por estas tecnologías 50 por ciento fue positivo, además se confirmaron 203 casos pertenecientes a 4 brotes epidémicos, así como 12 enfermos vacunados con vaxSPIRAL®, demostrándose la eficacia de la vacuna (78,1 por ciento). Se desarrolló y aplicó un sistema látex para pesquisa rápida de leptospirosis (LeptoCuba), con excelente sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y estabilidad. La aplicación de nuevas tecnologías a la pesquisa y confirmación rápida de la enfermedad, permitió incrementar la positividad y calidad del diagnóstico en el período 2002-2006, fortaleciéndose la vigilancia microbiológica en el país.

For the first time in Cuba the rapid serologic technologies available worldwide were evaluated for the screening and confirmation of human leptospirosis. As its clinical recognition is difficult, the fast etiological diagnosis is of vital importance. Sensitivity and specificity values higher than 90 percent were obtained in the confirmatory systems, and of 85 percent in the screening systems. Of the severe patients studied by these technologies 50 percent were positive. 203 cases corresponding to 4 epidemic outbreaks were confirmed, as well as 12 sick persons vaccinated with vaxSPIRAL®, which demonstrates the vaccine effectiveness (78.1 percent). We developed and applied a latex system for a rapid screening of leptospirosis (LeptoCuba), with an excellent sensitivity, specificity, reproducibility, and stability. The application of new technologies for the screening and fast confirmation of the disease allowed to increase the positivity and quality of the diagnosis from 2000 to 2006, strengthening the microbiological surveillance in the country

Resultados preliminares de la evaluación del primer sistema látex en el diagnóstico rápido de la leptospirosis humana en Cuba / Preliminary results of the evaluation of the first latex system in the rapid diagnosis of human leptospirosis in Cuba

Se elaboró un látex de aglutinación de producción nacional (leptospira - látex - IPK) para el diagnóstico rápido de la leptospirosis humana. La dilución óptima de trabajo del antígeno termorresistente (TR) acoplado a las partículas de látex fue de 1/80. Se emplearon partículas de látex comerciables de 0,8 µm. Se obtuvo una sensibilidad del 86,6 por ciento y una especificidad del 88,7. El índice de coincidencia entre el leptospira - látex - IPK y el lepto dri dot (estuche comercial) fue de un 85 por ciento. Al aplicar el método estadístico de X2, no existieron diferencias significativas entre el leptospira - látex-IPK, MAT (gold standard) y la hemaglutinación pasiva. Se obtuvo, de esta manera, el primer resultado biológico de látex en Cuba, útil en el diagnóstico rápido de la leptospirosis humana, el cual deberá ser evaluado en el terreno para determinar nuevos parámetros, entre ellos, la estabilidad y la reproducibilidad

Lepto tek lateral flow: un método para el diagnóstico rápido de la leptospirosis humana en Cuba / Lepto tek lateral flow: a method for the rapid diagnosis of human leptospirosis in Cuba

La técnica de Lepto tek lateral flow (LF) en el diagnóstico serológico y rápido de casos graves con sospecha clínica y epidemiológica de leptospirosis humana se introdujo y se aplicó en el Laboratorio Nacional de Referencia de Leptospiras (LNRL). Se emplearon las técnicas convencionales de laboratorio (microaglutinación [MAT] y hemaglutinación indirecta [HA]) en la confirmación de los casos en estudio. Se estudiaron 40 muestras de sueros correspondientes a 33 pacientes sospechosos de leptospirosis humana, de las cuales se obtuvo positividad en 21 de ellas mediante LF, que representa un 52,5 por ciento. Al aplicar comparativamente las técnicas de LF y HA en 26 monosueros y 7 pares de sueros, se obtuvieron 11 y 5 casos positivos respectivamente. La coincidencia entre ambas fue de un 73 por ciento al estudiar los monosueros y del 71,0 al estudiar los pares de sueros. Al aplicar la MAT en 9 casos sospechosos, resultaron 7 positivos. Los serogrupos más frecuentes encontrados fueron: icterohaemorrhagiae, y canicola. Se detectaron solo 5 casos positivos por las 3 técnicas aplicadas. La coincidencia entre las técnicas de MAT y LF fue del 89 por ciento y la de HA y la MAT del 100,0. La aplicación de la MAT y la HA ofreció confiabilidad en los resultados obtenidos y se evidenció la gran sensibilidad del LF. Se demostró la importancia del uso de sueros pareados para el diagnóstico certero de esta enfermedad

Respuesta de anticuerpos IgG antileptospira en individuos inmunizados con vax-SPIRAL / Response of antileptospira IgG antibodies in individuals immunized with vax-SPIRAL

Se aplicó un sistema ELISA cuantitativo para la detección de anticuerpos IgG en respuesta a la vacuna cubana contra la leptospirosis humana (vax-SPIRAL), a sueros de 930 voluntarios, 483 inmunizados con vax-SPIRAL y 447 con una vacuna contra la hepatitis B. Fueron estudiadas las muestras tomadas antes de comenzar el estudio, a los 21 d de aplicada la segunda dosis y al cabo del año. Se pudo observar una alta seroprevalencia de anticuerpos a los serovares vacunales antes de comenzar el estudio, un incremento al doble del valor inicial de la respuesta a los 21 d de la segunda dosis de la vacuna antileptospirósica en 45 por ciento de los individuos, existiendo diferencias marcadamente significativas (p= 0,000000) entre ambos grupos. Se detectó respuesta a los 3 serovares leptospirales de forma similar. Al cabo del año los niveles de anticuerpos caen, sin embargo, hay 23,1 por ciento de individuos que logran duplicar su nivel de anticuerpos respecto al momento inicial, manteniéndose la diferencia significativa con el grupo que recibió la vacuna contra hepatitis B. Se recomendó la continuación de la aplicación de este inmunógeno cubano a los principales grupos de riesgo

Alcalinización de la orina humana para el aislamiento experimental de leptospiras / Alkalinization of human urine for the experimental isolation of leptospiras

Se estudió el efecto de diferentes agentes alcalinizantes de la orina sobre el aislamiento de leptospiras. Se obtuvieron mejores resultados al emplear la solución básica de NaOH 1N y en la orina inoculada 1 h después de haber sido alcalinizada

Sistema de aglutinación con látex para el diagnóstico rápido de la leptospirosis en Cuba / Latex agglutination system for the rapid diagnosis of leptospirosis in Cuba

OBJETIVOS: Evaluar la sensibilidad, la especificidad, la reproducibilidad y la estabilidad de cinco sistemas de aglutinación con látex diseñados para detectar anticuerpos contra leptospira en sueros de humanos y de animales, basados en los serogrupos de Leptospirade mayor circulación en Cuba. MÉTODOS: Se realizó un estudio analítico descriptivo con 706 sueros humanos (65 sueros positivos a anticuerpos contra leptospira mediante microaglutinación (MAT) y hemaglutinación (HA); 156 sueros negativos, según MAT y HA; 485 sueros de 424 pacientes con signos clínicos o epidemiológicos de leptospirosis); y 29 sueros de animales (16 equinos, 6 bovinos, 5 porcinos, 1 canino y 1 ovino). Todas las muestras se evaluaron con cinco conjugados de látex con células enteras de Leptospira interrogans de los cuatro serogrupos de mayor circulación en Cuba en el período entre 2002 y 2004. Con las células obtenidas de los cultivos celulares de cepas tipo se obtuvieron cuatro conjugados específicos (látex-Canicola, látex-Icterohaemorrhagiae, látex-Pomona y látex-Sejroe) y un conjugado de látex con la mezcla de las células de esos cuatro serogrupos a partes iguales (látex-Pool). Adicionalmente, las muestras se evaluaron con el sistema comercial de aglutinación con látex Lepto Tek Dri Dot (bioMerieux, Francia). La estabilidad y la reproducibilidad de los conjugados de látex se evaluaron mediante controles mensuales durante 6 meses con sueros positivos y negativos. RESULTADOS: De los sistemas evaluados, la mejor combinación de sensibilidad y especificidad se observó con el conjugado látex-Pool (93,8 por ciento y 90,4 por ciento, respectivamente). La mejor combinación de valores predictivos positivos y negativos se observó con el conjugado látex-Sejroe (90,9 por ciento y 95,8 por ciento, respectivamente), seguido del conjugado látex-Pool (94,2 por ciento y 96,6 por ciento, respectivamente). Los valores predictivos positivo y negativo del sistema comercial Lepto Tek Dri Dot fueron 78,5 por ciento y 88,4 por ciento, respectivamente. De las 137 muestras de pacientes positivas a alguno de los serogrupos estudiados según MAT, los conjugados de látex lograron identificar correctamente 107 (78,1 por ciento), mientras que el conjugado látex-Pool detectó como positivos 116 sueros (84,7 por ciento). Al evaluar los sueros de animales, el conjugado látex-Pool detectó...

Objectives. To assess the sensitivity, specificity, reproducibility, and stability of five latex agglutination systems for detecting antibodies against leptospira in human and animal sera, by using the Leptospira serotypes that are most widely prevalent in Cuba. Methods. We performed an analytic and descriptive study with 706 human sera (65 tested positive for antibodies against leptospira with microagglutination (MAT) and hemagglutination (HA) techniques; 156 sera that tested negative with MAT and HA); 485 sera from 424 patients who had clinical or epidemiologic signs of leptospirosis; and 29 animal sera (16 from equines, 6 from bovines, 5 from porcines, 1 from a canine, and 1 from an ovine). All of the samples were tested with five latex conjugates made from whole cells of Leptospira interrogans, specifically the four serogroups that circulated most widely in Cuba from 2002 to 2004. The cells obtained from cultured cell lines yielded four specific conjugates (latex-canicola, latex-icterohemorrhagiae, latexpomona, and latex-sejroe), as well as one latex conjugate made from a combination of all four serogroups in equal quantities (latex-pool). In addition, samples were tested with the commercial latex agglutination Lepto Tek Tri Dot (bioMeriuex, France) kit. The stability and reproducibility of the latex conjugates were assessed through monthly controls over a period of 6 months with positive and negative sera. Results. Of the systems that were assessed, the best combination of sensitivity and specificity was obtained with the latex-Pool conjugate (93,8% and 90,4%, respectively). The best combination of positive and negative predictive values was seen with the latex-Sejroe conjugate (90,9% and 95,8%), respectively), followed by the latex-Pool conjugate (94.2% and 96.6%, respectively). The positive and negative predictive values of the Lepto Tek Dri Dot commercial system were 78.5% and 88.4%, respectively. Among the 137 patient samples that tested positive for one of the serotypes when MAT was used, latex conjugates succeeded in correctly identifying 107 (78.1%), whereas the latex-Pool conjugate detected 116 (84.7%) positive sera. When animal sera were tested, the latex-Pool conjugate detected the greatest number of positive serum samples and showed the greatest concordance with MAT (93.1%). The conjugates studied showed good stability and reproducibility. Conclusions. Latex conjugates made from whole cells of the most widely circulating leptospira in Cuba showed a degree of concordance with MAT that was similar to or better than that seen with the Lepto Tek Dri Dot commercial system, both in human and animal sera. We recommend more widespread use of the latex-Pool conjugate in Cuba in the initial screening for antibodies against leptospira

Respuesta serológica por ELISA y MAT en voluntarios cubanos vacunados con vax SPIRAL® / Serological response by ELISA and MAT in Cuban volunteers vaccinated with vax SPIRAL@

Se estudió la seroconversión en 408 individuos vacunados y 135 placebo, incluidos en 2 ensayos clínicos de la vacuna cubana contra la leptospirosis humana. Se estudiaron 2 dosis vacunales y 5 esquemas. Seroconvirtieron de 38 vacunados (Fase I), 11 (29 por ciento) por MAT y 12 (32 por ciento) por ELISA, y de 33 placebo, 2 (6 por ciento) y 3( 9 por ciento) respectivamente. En la Fase II de 68 vacunados (dosis de 0,25 mL) y de 65 (dosis de 0,50 mL), seroconvirtieron 21 (31 por ciento) y 16 (25 por ciento) por ELISA respectivamente, por MAT 9 (13 por ciento) y 7 (11 por ciento) individuos fueron positivos. No hubo diferencias significativas entre las dosis utilizadas. La seroconversión por MAT, en 237 individuos vacunados con diferentes esquemas, fue de 22,4 por ciento, no existiendo diferencias significativas entre estos. En la mayoría de los individuos reactivos, se encontraron niveles de anticuerpos al menos a una de las cepas vacunales. Se recomendó, buscar y evaluar otros métodos para demostrar in vivo, el nivel de protección de esta vacuna

Eficacia y seguridad de una vacuna contra la leptospirosis humana en Cuba / Efficacy and safety of a vaccine against human leptospirosis in Cuba

OBJETIVOS: Evaluar la eficacia de la vacuna cubana contra la leptospirosis vax-SPIRAL y aportar información adicional acerca de la seguridad de esta vacuna. MÉTODOS: Ensayo de eficacia (fase III) controlado, aleatorizado y con doble enmascaramiento de la vacuna cubana contra la leptospirosis vax-SPIRAL (Instituto Finlay, Cuba). Como control se utilizó la vacuna recombinante contra la hepatitis B Heberbiovac-HB (Heber Biotec, Cuba). Como unidad de aleatorización para la asignación al grupo de estudio o al grupo testigo se emplearon los 523 consultorios de los médicos de familia existentes en los municipios seleccionados. El estudio abarcó a toda persona de 20 a 64 años de edad de uno u otro sexo que residía en los municipios de Ranchuelo, Quemado, Santo Domingo, Encrucijada, Corralillo, Cifuentes y Camajuaní, en la provincia de Villa Clara, ubicada en la región central de Cuba, que aceptó participar voluntariamente en el ensayo. La vacunación se efectuó en los consultorios de los médicos de familia entre febrero y julio de 1998, con un intervalo de 6 semanas entre las dos dosis. El período de seguimiento fue de 12 meses. Se consideró positivo un caso si había recibido las dos dosis de la vacuna asignada y había enfermado de leptospirosis, con diagnóstico confirmado mediante métodos serológicos y microbiológicos, después de 21 días de aplicada la segunda dosis. Se calcularon la eficacia de la vacuna y el riesgo relativo (RR) de enfermar de leptospirosis después de la vacunación. Para el estudio de seguridad se escogió a dos personas al azar entre las personas vacunadas en cada uno de los consultorios que participaron en el estudio de eficacia. El seguimiento de las reacciones adversas locales y sistémicas lo realizaron los médicos de familia durante los siete días posteriores a la aplicación de cada dosis. El nivel de significación se fijó en 0,05...

Objectives. To evaluate the efficacy of vax-SPIRAL, a Cuban vaccine against leptospirosis, and to provide additional information concerning the safety of this vaccine (which was developed by Cuba's Finlay Institute). Methods. This phase III efficacy trial of vax-SPIRAL was controlled, randomized, and double blind. The control vaccine used for the trial was Heberbiovac-HB (Heber Biotec, Cuba), a recombinant hepatitis B vaccine. The randomization unit for allocating persons to the study group or the control group were 523 family physician offices in the selected municipalities. The study covered the entire population of males and participate, from the municipalities of Ranchuelo, Quemado, Santo Domingo, Encrucijada, Corralillo, Cifuentes, and Camajuaní, which are in the province of Villa Clara, in the central region of Cuba. The vaccinations were given in the physicians' offices between February and July 1998, with an interval of 6 weeks between the two doses. The follow-up period was 12 months. A case was considered positive if a person who had received the two doses of the vaccine became ill with leptospirosis more than 21 days after receiving the second dose, with the diagnosis confirmed through serological and microbiological methods. We calculated the efficacy of the vaccine and the relative risk of becoming ill with leptospirosis after the vaccination. For the safety study, two persons were chosen at random from among the individuals vaccinated at the office of each physician participating in the study. Follow-up of local and systemic adverse reactions was carried out by the family physicians during the seven days after the application of each dose. The level of statistical significance was set at 0.05. Results. A total of 101 832 persons were vaccinated, with 50 354 of them (49.4%) receiving the leptospirosis vaccine and 51 478 of them (50.6%) receiving the control vaccine. The efficacy of the vax-SPIRAL vaccine was 78.1% (95% confidence interval (CI): 59.2% to 88.3%), and the relative risk of becoming ill with leptospirosis after receiving the leptospirosis vaccine was 0.22 (95% CI: 0.12 to 0.41). General discomfort was the frequent systemic adverse reaction, and mild spontaneous pain at the injection site was the most frequent local effect. The local and systemic adverse reactions were both more frequent in the study group than in the control group (P = 0.003). There were no serious adverse events. Conclusion. The vax-SPIRAL vaccine proved to be safe and efficacious for leptospirosis control. The vaccine is recommended for use in preventing this disease among groups at risk of contracting it.

Diagnóstico serológico de sífilis en pacientes cubanos con VIH/SIDA / Serological diagnosis of syphilis in HIV/AIDS Cuban

Se utilizó la prueba no treponémica de detección rápida de reaginas plasmáticas y la prueba treponémica de hemaglutinación de Treponema pallidum, en la detección de la infección por T. pallidum en 60 hombres que presentaban la infección VIH/SIDA con diagnóstico clínico-epidemiológico de sífilis. Se confirmó que 30 por ciento presentaba sífilis reciente adquirida sintomática o latente y que 10 por ciento poseía marcadores de infección pasada tratada o de sífilis tardía adquirida latente, mientras que en 60 por ciento restante no se detectó reactividad serológica. Se realizó, además, un estudio de seroprevalencia de anticuerpos reagínicos por detección rápida de reaginas plasmáticas en 59 mujeres con VIH/SIDA, utilizando como control 67 mujeres negativas a este virus, todas sin síntomas compatibles con la infección sifilítica. Se obtuvo que 20,3 y 11,9 por ciento, respectivamente, mostraban reactividad, lo que estableció un diagnóstico probable de sífilis o una serorresitencia a una sífilis anterior. Estos resultados muestran una fuerte asociación entre sífilis y VIH/SIDA y que ambas enfermedades pueden coexistir en un mismo paciente

Importancia de la confirmación microbiológica en un brote de leptospirosis humana en la ciudad de Villa Clara / Importance of the microbiological confirmation in an outbreak of human leptospirosis in the city of Villa Clara

Se creó un grupo multidisciplinario encargado de confirmar la existencia de leptospirosis humana en la provincia Villa Clara, en la cual a finales del mes de junio de 1997, se produjo un incremento considerable de casos febriles con síntomas y signos compatibles con enfermedades como dengue hemorrágico y leptospirosis humana. El Laboratorio Nacional de Referencia de Leptospiras del Instituto ôPedro Kouríö, organizó como estrategia de trabajo un conjunto de técnicas directas e indirectas de diagnóstico que sirvieran para confirmar el problema de salud presentado. Como resultados finales, se obtuvieron que los serogrupos Ballum, Pomona, Canicola e Icterohaemorrhagiae, fueron los de mayor porcentaje de aparición entre los casos estudiados. Un total de 7 casos presentaron infección activa, fueron positivos por el método de hemaglutinación pasiva. Los 4 casos graves estudiados por hemaglutinación pasiva y por microaglutinación fueron positivos. Resultaron negativos por estas 2 técnicas, los sueros de los 3 pacientes con síndrome febril de etiología desconocida. Las 3 muestras obtenidas de la autopsia de un fallecido fueron reactivas por examen directo en campo oscuro y tinción de la inmunoperoxidasa. Los monosueros de las personas fallecidas fueron altamente reactivos por hemaglutinación pasiva (títulos desde 1-10 y hasta 1-640). Fueron tipados 2 hemocultivos como Ballum; 2 orinas y 1 hemocultivo fueron positivos por reacción en cadena de la polimerasa. De esta forma se ofreció una respuesta rápida a las autoridades de salud pública del Viceministerio de Higiene y Epidemiología de Cuba, al confirmarse microbiológicamente la existencia de la enfermedad, y se sugirió la posibilidad de aplicar la vacuna de producción nacional vax SPIRAL en el área afectada