Efeito isolado ou combinado de flavonoides e peptídeos catiônicos sobre biofilme endodôntico e sua influência na viabilidade celular, capacidade de migração e inibição de citocinas em fibroblastos / Effect of flavonoids and cationic peptides, alone or in combination, on endodontic biofilm and their influence on cell viability, migration capacity and inhibition of cytokines in fibroblasts

Este trabalho foi dividido em dois capítulos que objetivou avaliar: 1) o efeito isolado ou combinado do flavonoide epigallocatechin-3-gallate (EGCG) em associação com o peptídeo LL-37 e seu análogo KR-12-a5 sobre a viabilidade celular de fibroblastos e sobre cultura planctônica, biofilme simples, dual-espécies e túbulos dentináios e 2) as interações sinérgicas do EGCG e proantocianidina do oxicoco (A-type cranberry proanthocyanidins, AC-PAC), quando usado em combinação com LL-37 ou KR-12-a5 sobre a viabilidade celular, a capacidade de migração e inibição das citocinas em cultura de fibroblastos (HGF-1), quando estimuladas ou não pelo lipopolissacarídeo de A. actinomycetencomitans (LPS). No capítulo 1, a concentração inibitória mínima (MIC), a concentração bactericida mínima (MBC) e concentração inibitória fracionária (FIC) de EGCG, LL-37 e KR-12-a5 foram determinadas a partir de valores decrescentes dos compostos por meio dos métodos de microdiluição e checkerboard contra Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Actinomyces israelii e Fusobacterium nucleatum após 24 horas de tratamento. Fibroblastos da linhagem L-929 foram expostos a combinações de EGCG com peptídeos em diferentes concentrações e o metabolismo celular avaliado por ensaios de MTT. Os compostos com melhor efeito antimicrobiano e citotóxico foram avaliados por 24-36h, isoladamente ou em combinação, em biofilmes individuais ou biofilmes de dual-espécies com E. faecalis formados em placas de poliestireno por 48h por meio de contagem bacteriana. Os biofilmes de E. faecalis também foram cultivados em túbulos dentinários por 2 semanas, tratados com EGCG, KR-12-a5 e EGCG + KR-12-a5 e a porcentagem de células mortas foi determinada pela análise de imagens usando Microscopia Confocal. No capítulo 2, a linhagem celular de fibroblastos gengivais humanos primários HGF-1 foi pré-tratada durante 2 h com EGCG ou AC-PAC a 25 e 12,5 µg / mL, LL-37 ou KR-12-a5 a 0,06 e 0,03 µM ou com uma combinação de EGCG + ACPAC; AC-PAC + KR-12-a5; AC-PAC + LL-37; EGCG + KR-12-a5 ou EGCG + LL-37, nas mesmas concentrações. As culturas celulares foram então estimuladas com 50 µg/mL de LPS por 24-48h. A viabilidade celular e migração foram analisadas usando ensaios colorimétricos e fluorescentes, respectivamente. A quantificação de citocinas foi determinada por ensaios multiplex ELISA. Os resultados mostraram que em condições planctônicas, EGCG + KR-12-a5 apresentaram efeito sinérgico ou aditivo contra todas as bactérias testadas, com FIC menor que os valores de MIC obtidos pelos compostos isolados. As combinações de EGCG e peptídeos testados não foram tóxicas para os fibroblastos, uma vez que o crescimento celular foi superior a 70%. Em condições de biofilme simples, EGCG + KR-12-a5 eliminou S. mutans e A. israelii e reduziu E. faecalis e F. nucleatum. Para biofilmes de duas espécies, quando E. faecalis foi combinado com S. mutans, EGCG + KR-12-a5 teve efeito sinérgico eliminando S. mutans e reduzindo estatisticamente as contagens de E. faecalis. Em biofilmes associando E. faecalis e A. israelii ou F. nucleatum, EGCG + KR-12-a5 eliminaram E. faecalis e promoveram redução de A. israelii e F. nucleatum, embora não tenha sido observada diferença estatística entre os compostos. EGCG + KR-12-a5 reduziu mais de 80% dos biofilmes de E. faecalis nos túbulos dentinários. Dentre os grupos experimentais estudados, o EGCG, principalmente a 25 e 12,5 µg/mL estimulou o crescimento de fibroblastos, protegendo-os dos efeitos do LPS. Efeito sinérgico entre EGCG + AC-PAC, EGCG + LL-37 e EGCG + KR-12-a5 no metabolismo celular também foi observado na presença de LPS. Combinações do EGCG com AC-PAC ou KR-12-a5 e AC-PAC com LL-37 foram capazes de aumentar estatisticamente a migração celular. EGCG, AC-PAC, LL-37 e KR-12-a5 promoveram a redução de citocinas individualmente ou em combinação (EGCG + AC-PAC e EGCG + KR12-a5) mais especificamente para IL-6, IL-8, GM- CSF e TNF-α. Conclui-se que a associação de EGCG e KR-12-a5 é citocompatível e promove um efeito sinérgico contra bactérias associadas a infecções endodônticas, sob condições planctônicas e de biofilme. O EGCG, isoladamente ou associado ao AC-PAC e ao KR-12-a5, aumenta a viabilidade e migração celular, bem como a inibição de citocinas por fibroblastos estimulados por LPS. A associação de EGCG com KR-12-a5 poderia ser uma opção de princípio ativo em medicações para fins endodônticos(AU)

This study was divided in two chapters that aimed to evaluate: 1) the effect of flavonoid epigallocatechin-3-gallate (EGCG), cationic peptide LL-37 peptide and its analogue KR12-a5, alone or in combination, on fibroblast cell viability and on bacteria in planktonic and single/dual-species biofilms/dentin tubules; 2) the synergistic interactions of EGCG and cranberry proanthocyanidins (A-type cranberry proanthocyanidins, AC-PAC), when used in combination with LL-37 or KR-12-a5 on cell viability, the ability to induce cell migration and inhibit cytokines in culture of fibroblasts (HGF-1) when stimulated or not by the lipopolysaccharide of A. actinomycetencomitans (LPS). For the chapter 1, Minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) and fractional inhibitory concentration (FIC) of EGCG, LL-37 and KR-12-a5 were determined from decreasing values of the compounds by Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Actinomyces israelii and Fusobacterium nucleatum against microdilution and checkerboard after 24 hours of treatment. L-929 fibroblasts were exposed to combinations of EGCG with peptides at different concentrations and cell metabolism assessed by MTT assays. The compounds if the best antimicrobial and cytotoxic effect were also evaluated for 24-36h, alone or in combination, in 48h singleor dual-species biofilms with E. faecalis formed on polystyrene plates by bacterial counting. E. faecalis biofilms were also cultured in dentin tubules for 2 weeks and treated with EGCG, KR-12-a5 and EGCG + KR-12-a5 to determine the percentage of dead cells by analysis of images using Confocal Microscopy. For the chaper 2, primary human gingival fibroblast HGF-1 cell line was pretreated for 2 h with either EGCG or AC-PAC at 25 and 12.5 µg/mL, LL-37 or KR-12-a5 at 0.03 and 0.06 µM or with a combination of EGCG + AC-PAC; AC-PAC + KR-12-a5; AC-PAC + LL-37; EGCG + KR-12-a5 or EGCG + LL37, at the same concentrations. Cell cultures were then stimulated with 50 µg/mL LPS for 24-48h. Cell viability and migration were analyzed using colorimetric and fluorescent assays, respectively. Quantification of cytokines was determined by multiplex ELISA assays. The results show that in planktonic conditions, EGCG + KR-12- a5 showed a synergistic or additive effect against all the bacteria tested, with FIC lower than the MIC values obtained by the compounds alone. Combinations of EGCG and peptides tested were not toxic to fibroblasts, since cell growth was higher than 70%. Under single biofilm conditions, EGCG + KR-12-a5 eliminated S. mutans and A. israelii and reduced E. faecalis and F. nucleatum. For dual- species biofilms, when E. faecalis was combined with S. mutans, EGCG + KR-12-a5 had a synergistic effect by eliminating S. mutans and statistically reducing E. faecalis counts. In biofilms associated with E. faecalis and A. israelii or F. nucleatum, EGCG + KR-12-a5 eliminated E. faecalis and promoted reduction of A. israelii and F. nucleatum, although no statistical difference was observed between the compounds. EGCG + KR-12-a5 reduced more than 80% of the E. faecalis biofilms in the dentin tubules. Among the experimental groups studied, EGCG, mainly at 25 and 12.5 µg/mL stimulated the growth of fibroblasts, protecting them from the effects of LPS. Synergistic effect between EGCG + AC-PAC, EGCG + LL-37 and EGCG + KR12-a5 on cell metabolism was also observed in the presence of LPS. Combinations of EGCG with AC-PAC or KR-12-a5 and AC-PAC with LL-37 were able to increase statistically cell migration. EGCG, AC-PAC, LL-37 and KR-12-α5 promoted cytokine reduction individually or in combination (EGCG + AC-PAC and EGCG + KR-12-a5) more specifically for IL-6, IL-8, GM-CSF and TNF-α. The association of EGCG and KR-12-a5 was cytocompatible and promoted a synergistic effect against bacteria associated with endodontic infections under planktonic and biofilm conditions. EGCG, alone or in combination with AC-PAC and KR-12-a5, increases cell viability and migration, as well as inhibition of cytokines by LPS-stimulated fibroblasts. The association of EGCG with KR12-a5 could be an option as active principle for medications to be used for endodontic purposes(AU)

Efeito microbiológico e citotóxico de sistemas nanoestruturados bioadesivos contendo fragmentos de peptídeos / Microbiological and citotoxicity effect of nanostructured bioadhesive system containing peptide fragments

O uso de agentes antimicrobianos naturais que reduzam a adesão e proliferação de S. mutans no biofilme poderia ser uma estratégia interessante para o controle da cárie dentária. No entanto, a estabilidade química e física de alguns desses agentes, como os peptídeos catiônicos antimicrobianos e fragmentos de peptídeos, pode ser comprometida por fatores externos, como temperatura e pH, reduzindo sua ação antimicrobiana. Com isso, os objetivos deste estudo foram desenvolver e caracterizar sistemas de liberação de fármaco nanoestruturados bioadesivos para a incorporação dos fragmentos peptídicos D1-23 e P1025 e avaliar seu efeito citotóxico e atividade contra biofilme de S. mutans. A primeira formulação (F1), composta de ácido oleico, polyoxypropylene-(5)-polyoxyethylene-(20)-cetyl alcohol (PPCA), Carbopol® 974P e Carbopol® 971P, foi analisada por microscopia de luz polarizada (MLP), reologia e bioadesão in vitro. A concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) de D1-23 foram determinadas contra S. mutans para posterior avaliação da atividade sobre biofilme formado após 4h e 24h de tratamento. A segunda formulação (F2) foi selecionada a partir de três diferentes concentrações de ácido oleico, PPCA e Carbopol® 974P. Cada formulação foi analisada por MLP, espalhamento de raios x a baixo ângulo (SAXS), reologia e bioadesão. CIM e CBM de P1025 sobre S. mutans e seu efeito quando incorporado ou não em F2 sobre biofilme de S. mutans em formação foram analisados. A citotoxicidade em células epiteliais HaCat foi avaliada para os dois sistemas líquido cristalino (SLC) usando testes de MTT. Análise descritiva foi realizada para os dados dos ensaios de caracterização e para os ensaios microbiológicos e citotóxicos os dados foram submetidos aos testes de ANOVA/Tukey ou Kruskall-Wallis/Mann-Whitney U (p<0.05). Os resultados indicaram que F1 apresentou características de SLC com alta viscosidade e bioadesão. CIM e CBM de D1-23 foram de 15,60 e 31,25µg/mL, respectivamente. D1-23 incorporado em F1 apresentou melhores resultados contra biofilme de S. mutans que quando em solução, após 24h de tratamento. F2 apresentou melhores propriedades reológicas e força bioadesiva comparada aos demais sistemas, caracterizando um SLC. P1025 teve somente efeito inibitório sobre S. mutans (CIM=0.25 mg/mL). O efeito antibiofilme de P1025 incorporado em F2 foi observado após 24h de tratamento, principalmente quando aplicado na fase de adesão. Ambos os SLC contendo D1-23 e P1025 não apresentaram toxicidade sobre as células epiteliais, nas condições de tempo e concentrações avaliadas. A incorporação de peptídeos em SLC bioadesivos nanoestruturados aumenta suas propriedades antimicrobianas, podendo ser uma interessante estratégia para a prevenção da cárie dentária(AU)

The use of natural antimicrobial agents for reducing the adhesion and proliferation of S. mutans in the biofilm could be an interesting strategy for the control of dental caries. However, the chemical and physical stability of some natural antimicrobials, such as cationic antimicrobial peptides and peptide fragments, can be compromised by external factors such as temperature and pH, reducing their antimicrobial action. Thus, the objectives of this study were to develop and characterize nanostructured bioadhesive drug delivery systems for the incorporation of D1-23 and P1025 peptide fragments and to evaluate their citotoxicy and activity against S. mutans biofilm. The first formulation (F1) was composed of oleic acid, polyoxypropylene- (5) -polyoxyethylene- (20) - cetyl alcohol (PPCA), Carbopol® 974P and Carbopol® 971P and analyzed by polarized light microscopy (PLM), rheology and in vitro bioadhesion. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal bacterial concentration (MBC) of D1-23 were determined against S. mutans for further evaluation of activity against S. mutans biofilm after 4h and 24h of treatment. The second formulation was selected from three different concentrations of oleic acid, PPCA and Carbopol® 974P. Each formulation was analyzed by PLM, small-angle x-ray scattering (SAXS), rheology and bioadhesion. MIC and MBC of P1025 were determined against S. mutans. Thus, P1025 was incorporated in the best formulation (F2). The effect of P1025 incorporated or not into F2 on S. mutans biofilm formation was analyzed. Cytotoxicity in HaCat epithelial cells for both formulations was evaluated using MTT assays. Descriptive analysis was performed for the characterization assays and data from microbiological and cytotoxic assays were submitted to ANOVA / Tukey or Kruskall-Wallis / Mann-Whitney U (p<0.05). The results indicated that F1 presented characteristics of liquid-crystalline type system (LCS) with high viscosity and bioadhesion. The MIC and MBC of D1-23 were 15.60 and 31.25µg / mL, respectively. D1-23 incorporated in F1 showed better results than D1-23 in solution against S. mutans biofilm after 24h. F2 had better rheological properties and bioadhesive strength compared to other systems analyzed and characteristics of LCS. P1025 had only inhibitory effect against S. mutans (MIC=0.25mg/mL). The antibiofilm effect of P1025 incorporated into F2 was observed after 24h of treatment, mainly when applied in surface-bound salivary phase. Both LCS had no toxicity on epithelial cells, considering time and concentrations tested. The incorporation of peptides in nanostructured bioadhesive LCS increased their antimicrobial properties and could be an interesting strategy for caries prevention(AU)

Peptídeos catiônicos e flavonoides como alternativas biológicas para aplicação em odontologia: efeito antimicrobiano, citotóxico e na indução de mineralização / Cationic peptides and flavonoids as biological alternatives in dentistry: antimicrobial, cytotoxic and mineralization induction effects

O presente estudo avaliou o efeito antimicrobiano, citotóxico e na indução de mineralização de peptídeos catiônicos e flavonoides para aplicação em Odontologia. Para isso, foram realizados 7 estudos que neste trabalho foram divididos em capítulos. Os capítulos 1 e 2 tiveram por objetivo avaliar a toxicidade em células epiteliais (linhagens HaCat e OBA-9) e o efeito de fragmentos de peptídeos catiônicos sobre bactérias cariogênicas em condições planctônicas e sobre biofilme e posteriormente inserir o fragmento peptídico com melhor efeito antimicrobiano em um sistema líquido cristalino (SLC), previamente caracterizado por microscopia de luz polarizada, reologia e ensaio de bioadesão, e avaliar seu efeito sobre biofilme de Streptococcus mutans. Os capítulos 3 e 4 avaliaram a toxicidade em fibroblastos (linhagem 1929) e a atividade antimicrobiana/antibiofilme de análogos de peptídeos catiônicos sobre microrganismos de interesse endodôntico e seu efeito sobre os marcadores de mineralização dentinária: atividade da fosfatase alcalina (ALP), formação de nódulos de mineralização (NM) e expressão dos genes DSPP ­ sialofosfoproteína dentinária e DMP-I ­ fosfoproteína da matriz dentinária) em células semelhantes a odontoblastos da linhagem MDPC-23. O capítulo 5 teve por objetivo avaliar a atividade antimicrobiana/antibiofilme dos flavonoides: taxifolina, galangina, pinocembrina e crisina e sua toxicidade sobre fibroblastos L929. Na sequência, os capítulos 6 e 7 avaliaram o potencial da taxifolina sobre a indução de marcadores de mineralização dentinária (ALP, NM, expressão dos genes DSPP e DMP-I) nas células MDPC-23 e óssea (ALP, NM e expressão dos genes ALP e COL-I ­ colagenase 1) nas células semelhantes a osteoblastos da linhagem Saos-2, utilizando tratamentos de 24, 72h e contínuo. Os resultados dos capítulos 1 e 2 mostraram que, dentre os peptídeos testados, DI-23, fragmento da porção N-teminal do Defb14-1CV (ortólogo do hBD-3), apresentou o melhor efeito sobre cultura de S. mutans, S. mitis and S. salivarius e potente ação contra biofilme de cepas padrão e clínicas de S. mutans, além de baixa toxicidade em células epiteliais. Na presença de saliva, o SLC demonstrou alta viscosidade e altos valores de bioadesão. O SLC contendo DI-23 apresentou melhor efeito antibiofilme após 24h quando comparado à 4h de tratamento e não apresentou citoxicidade, nas condições testadas. Os resultados dos capítulos 3 e 4 mostraram que os peptídeos afetaram o metabolismo de L929 em concentrações acima de 500 gg/mL. KR-12-a5 inibiu o crescimento de todos os microrganismos testados, em baixas concentrações, e reduziu significativamente os biofilmes de S. mutans e Enterococcus faecalis formados nos túbulos dentinários. KR-12-a5 também estimulou a deposição inicial de NM, similar aos outros peptídeos, entretanto, em concentrações mais baixas e minimamente tóxicas. Nenhum peptídeo influenciou a expressão de DMP-I e DSPP nas células MDPC-23, nas concentrações testadas. No capítulo 5, a taxifolina não causou toxicidade sobre 1929 em nenhuma concentração testada e apresentou o melhor efeito inibitório sobre cultura de E. faecalis, S. mutans e Actinomyces israelii. Esse flavonoide também foi capaz de eliminar biofilmes de E. faecalis e S. mutans e reduzir significativamente biofilme de A. israelii em placas de poliestireno, além de reduzir substanciamente biofilme de E. faecalis no interior dos túbulos dentinários. No capítulo 6, o tratamento com taxifolina a 10gM por 72h estimulou a atividade de ALP, a formação de NM e a expressão de DMP-I. Taxifolina a 5gM por 24h estimulou a expressão de DSPP nas células MDPC-23. No capítulo 7, taxifolina a 10gM por 24h estimulou a atividade e a expressão de ALP e COL-I e taxifolina a 10gM a por 72h estimulou a formação de NM e também a expressão de COL-I. Conclui-se que os peptídeos DI-23 e KR-12-a5 são potentes agentes antimicrobianos e antibiofilme. A taxifolina, além da ação antimicrobiana/antibiofilme, também demonstrou capacidade de indução de marcadores fenotípicos e genotípicos de mineralização dentinária e óssea, indicando seu potencial uso em Odontologia(AU)

The present study evaluated the antimicrobial, cytotoxic and mineralization induction effects of cationic peptides and flavonoids for application in Dentistry. Seven studies were carried out and divided into chapters for this work. Chapters 1 and 2 aimed to evaluate the toxicity in epithelial cells (HaCat and OBA-9 lines) and the effect of cationic peptide fragments on cariogenic bacteria under planktonic and biofilm conditions and the peptide fragment with the best effect was incorporated in a crystalline liquid system (SLC) previously characterized by polarized light microscopy, rheology and bioadhesion assay, and to evaluate its effect on biofilm of clinical and standard strains of S. mutans. Chapters 3 and 4 evaluated the toxicity on fibroblasts (line L929) and the antimicrobial/antibiofilm activity of analogs of cationic peptides on microorganisms of endodontic interest and their effect on the markers of dentin mineralization: alkaline phosphatase activity (ALP), formation of mineralization nodules (MN) and expression of DSPP dentin sialophosphoprotein and DMP-I - dentin matrix phosphoprotein genes) in MDPC-23 odontoblasts-like cells. The objective of chapter 5 was to evaluate the antimicrobial/antibiofilm activity of the flavonoids: taxifolin, galangin, pinocembrin and chrysin and their toxicity on L929 fibroblasts. In addition, chapters 6 and 7 evaluated the potential of taxifolin on the induction of dentin mineralization markers (ALP, MN, DSPP and DMP-I gene expression) in MDPC-23 and bone mineralization markers (ALP, MN, ALP and COL-1-collagenase 1 gene expression) in the osteoblast-like cells of Saos-2 line, using 24h, 72h and continuous treatments. The results of chapters 1 and 2 showed that, among the peptides tested, DI-23, fragment of the N-terminal portion of Defb14-1CV (hBD-3 ortholog), showed the best effect on culture of S. mutans, S. mitis and S. salivarius and potent biofilm action on standard and clinical strains of S. mutans, as well as low toxicity in epithelial cells. In the presence of saliva, SLC demonstrated high viscosity and high bioadhesion values. SLC containing DI-23 presented better antibiofilm effect after 24h when compared to 4h of treatment and did not present cytotoxicity under the conditions tested. The results of chapters 3 and 4 showed that peptides affected the metabolism of L929 at concentrations above 500 gg/mL. KR-12-a5 inhibited the growth of all tested microorganisms at low concentrations and significantly reduced the biofilms of S. mutans and E. faecalis formed in dentin tubules. KR-12-a5 also stimulated the initial deposition of MN, similar to the other peptides, however, in lower and minimally toxic concentrations. No peptide influenced the expression of DMP-I and DSPP in MDPC-23 cells. In Chapter 5, taxifolin no cause toxicity on L929 at any tested concentration and it had the best effect against culture of Actinomyces israelii, S. mutans and E. faecalis. This flavonoid was also able to eliminate biofilms of E. faecalis and S. mutans and significantly reduce A. israelii biofilm on polystyrene plates, besides substantially reducing E. faecalis biofilms within dentinal tubules. In chapter 6, treatment with taxifolin at IOgM for 72h stimulated ALP activity, MN formation and DMP-I expression. Taxifolin at 51.1Mfo r 24h stimulated DSPP expression in MDPC-23 cells. In chapter 7, taxifolin at 10gM for 24h stimulated the activity and expression of ALP and COL-I and taxifolin at 10gM for 72h stimulated MN formation and also expression of COL-I. It is concluded that peptides DI-23 and KR-12-a5 are potent antimicrobial and antibiofilm agents. Taxifolin, besides the antimicrobial/antibiofilm action, also demonstrated the capacity for induction of phenotypic and genotypic markers of dentin and bone mineralization, indicating their potential use in Dentistry(AU)

Análise do perfil fenotípico e funcional das células natural Killer e linfócitos TCD8+ no Líquen plano / Analysis of phenotypic and functional profile of Natural Killer cells and CD8 + T lymphocytes in Lichen planus

Líquen plano (LP) é uma doença mucocutânea de natureza inflamatória crônica de etiologia ainda desconhecida. Alterações na resposta imune inata, como aos padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) podem levar à inflamação crônica e contribuir com a patogênese do LP. OBJETIVO: Avaliar o efeito da ativação via o DAMP S100A8 e o receptor Toll-like 4 (TLR-4) em células Natural killer (NK) e TCD8 citotóxicas e suas subpopulações de memória/efetoras em pacientes com LP. MÉTODOS: Foram selecionados 25 pacientes com LP (22 mulheres, 3 homens) com idade média de 43,46 anos ± 8,46 e um grupo controle com 25 indivíduos (22 mulheres, 3 homens) com idade média de 42 anos ± 5,5. A determinação transcricional e da expressão por imunohistoquimica dos DAMPs S100A8, HMGB-1 e de TLR-4 e RAGE foi realizada em biópsias de lesões cutâneas de indivíduos com LP, e os níveis séricos de S100A8, HMGB-1, MICA e MICB foram determinados por ELISA. As células mononucleares (CMNs) de sangue periférico foram avaliadas por citometria de fluxo quanto a frequência de TNF, IL-1beta e o marcador de desgranulação CD107a em células TCD8+ e células NK CD56+ e suas subpopulações. A avaliação da via de sinalização de TLR em células TCD8+ purificadas e ativadas com S100A8 foi analisada por PCR array e a determinação da expressão de mRNA dos componentes do inflamassoma em células TCD8+ ativadas com S100A8 por PCR em tempo real. RESULTADOS: Foi evidenciado nos indivíduos com LP elevada expressão da proteína S100A8 nas lesões cutâneas e de HMGB-1, TLR-4 e RAGE na derme, em paralelo ao aumento da expressão de mRNAs para S100A8 e S100A9 e diminuição de RAGE. Além disto, uma elevação dos níveis séricos do dímero S100A8/A9 foi detectada nos pacientes comparados aos controles, ao contrário do DAMP HMGB-1 que mostrou níveis similares em ambos os grupos. A influência do S100A8 em células TCD8+ e células NK, foi analisada em CMNs pela ativação...

Lichen planus (LP) is a mucocutaneous inflammatory chronic disease of unknown etiology. Alterations in the innate immune response such as the pathogen-associated molecular pattern (PAMPs) and damage-associated molecular pattern (DAMPs) can lead to chronic inflammation and contribute to the pathogenesis of LP. OBJECTIVE: Evaluate the effect of the activation trough the DAMP S100A8 and the Toll-like receptor 4 (TLR-4) on the Natural killer cells (NK) and cytotoxic TCD8 cells and their memory / effector subsets in LP disease. METHODS: We selected 25 patients with LP (22 women, 3 men) with a mean age of 43.46 years ± 8.46 and a control group of 25 subjects (22 women, 3 men) with a mean age of 42 ± 5, 5. The transcriptional determination and protein expression by immunohistochemistry of DAMPs, S100A8 and HMGB-1 as well as TLR-4 and RAGE was performed on biopsies of skin lesions from patients with LP, and serum levels of S100A8, HMGB-1, MICA and MICB were determined by ELISA. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were assessed by flow cytometry to evaluate the frequency of TNF, IL-1beta and the degranulation marker CD107a in CD8+ T cells and CD56 + NK cells and their subsets. The evaluation of the TLR signaling pathway in purified CD8 + T cells activated with S100A8 were analyzed by PCR array and the determination of mRNA expression of inflammasome components on CD8 + T cells activated by S100A8 was measured by real time PCR. RESULTS: It was shown in the LP individuals an increased expression of the S100A8 protein in the cutaneous lesions and HMGB-1, TLR-4 and RAGE in the dermis, in parallel to increased level of mRNAs for S100A8 and S100A9 and decreased expression of RAGE. Moerover, increased serum levels of the dimer S100A8 / A9 was detected in patients compared to controls, in contrast to DAMP HMGB1 that revealed similar levels in both groups. The influence of S100A8 in CD8 + T cells and NK cells, was analyzed in PBMC activating with...

Diseño de péptidos basado en la secuencia análoga al represor negativo icaR de Staphylococcus sp / Design of peptides based on similar sequence of negative repressor icaR of Staphylococcus sp / Desenho de peptídeos com base na sequência similar ao repressor negativo icaR dos Staphylococcus sp

La biopelícula como un mecanismo de virulencia en Staphylococcus involucrada en infecciones intrahospitalarias es regulada por un represor negativo icaR, responsable de la transcripción completa del operón icaADBC. La búsqueda de dominios funcionales por modulación computacional de icaR permitió hallar las secuencias peptídicas con actividad biológica análoga a la proteína icaR. Mediante biología computacional se diseñaron péptidos empleando el programa de predicción AntiBP (http://www.imtech.res.in/raghava/antibp/); la síntesis química se hizo por Nα-Fmoc y se caracterizaron y purificaron tres moléculas por RP-HPLC y MALDI-TOF. Se evaluó su seguridad biológica mediante ensayo de actividad citotóxica realizada sobre macrófagos murinos de la línea J774 y la actividad hemolítica se determinó mediante el uso de glóbulos rojos. Los tres péptidos caracterizados IR1, IR2 e IR3, presentaron estructura secundaria predominantemente alfa helicoidal, alto grado de pureza y alto score antimicrobiano; además, mostraron baja toxicidad, evidenciada por la actividad citotóxica y hemolítica en las concentraciones ensayadas y en comparación con los controles usados, que permitiría su potencial uso como moléculas candidatas o principios activos con actividad análoga al represor nativo icaR, frente a la biopelícula de los Staphylococcus sp.

Staphylococcus sp. biofilm, formed as a mechanism of virulence that is involved in hospital acquired infections, is regulated by a negative repressor icaR, which is responsible for the full transcription of the operon icaADBC. This study, through functional commands by computational modulation of icaR, allowed to find peptide sequences with similar biological activity to the icaR protein. Peptides were designed by means of computational biology using the prediction program AntiBP (http://www.imtech.res.in/raghava/antibp/). The chemical synthesis of peptides was performed by Nα-Fmoc. The purification and characterization of three molecules were carried out using RP-HPLC and MALDI-TOF. Biological safety of peptides was evaluated by tests of cytotoxic activity on murine macrophage cells line J774, and their hemolytic activity was determined by using red cells. The three characterized peptides IR1, IR2 and IR3 presented a predominantly secondary alpha helical structure with a high degree of purity and high antimicrobial scores. In addition, the peptides exhibited low toxicity, proved by their low cytotoxic and hemolytic activity in the tested concentrations and in comparison to the standards used. These results allow the potential use of these peptides as candidate molecules or active principles with similar activity to the native repressor icaR against the Staphylococcus biofilm.

O biofilme formado como um mecanismo de virulência em Staphylococcus sp., que está envolvido com infecções intra-hospitalares, é regulado por um repressor negativo icaR, o qual é responsável pela plena transcrição do operão icaADBC. Por tanto, o presente estudo, avaliando a segurança biológica de moléculas, concebeu peptídeos antibiofilme semelhantes ao repressor icaR. Por meio da biologia computacional foram concebidos peptídeos usando o programa de predição AntiBP (http://www.imtech.res.in/raghava/antibp/) para identificar as sequências com uma atividade biologicamente similar à da proteína icaR. A Síntese química dos peptídeos se fez pelo Nα-Fmoc e foram caracterizadas e purificadas três moléculas por RP-HPLC e MALDI-TOF. O ensaio de atividade citotóxica foi realizado nos macrófagos murinos da linha J774 e a atividade hemolítica foi determinada por meio do uso de glóbulos vermelhos. Foram caraterizados três peptídeos IR1, IR2 e IR3, além de mostrarem uma estrutura secundaria predominantemente alfa helicoidal, com alto grau de pureza, alto score antimicrobiano e baixa toxicidade, estes podem ser postulados como moléculas candidatas ou princípios ativos com uma atividade similar ao repressor nativo icaR frente ao biofilme dos Staphylococcus sp.

ß-defensin-2 in breast milk displays a broad antimicrobial activity against pathogenic bacteria / ß-defensina 2 no leite materno mostra uma ampla atividade antimicrobiana contra bactérias patogênicas

OBJECTIVE: To describe the antimicrobial activity of ß-defensin-2 produced in the mammary gland and secreted in human breast milk. METHODS: The peptide production was performed by DNA cloning. ß-defensin-2 levels were quantified in 61 colostrum samples and 39 mature milk samples from healthy donors, by an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Using halo inhibition assay, this study assessed activity against seven clinical isolates from diarrheal feces of children between 0 and 2 years of age. The activity of ß-defensin-2 against three opportunistic pathogens that can cause nosocomial infections was determined by microdilution test. RESULTS: The peptide levels were higher in colostrum (n = 61) than in mature milk samples (n = 39), as follows: median and range, 8.52 (2.6-16.3) µg/ml versus 0.97 (0.22-3.78), p < 0.0001; Mann-Whitney test. The recombinant peptide obtained showed high antimicrobial activity against a broad range of pathogenic bacteria. Its antibacterial activity was demonstrated in a disk containing between 1-4 µg, which produced inhibition zones ranging from 18 to 30 mm against three isolates of Salmonella spp. and four of E. coli. ß-defensin-2 showed minimum inhibitory concentrations (MICs) of 0.25 µg/mL and 0.5 µg/mL for S. marcescen and P. aeruginosa, respectively, while a higher MIC (4 µg/mL) was obtained against an isolated of multidrug-resistant strain of A. baumannii. CONCLUSIONS: To the authors' knowledge, this study is the first to report ß-defensin-2 levels in Latin American women. The production and the activity of ß-defensin-2 in breast milk prove its importance as a defense molecule for intestinal health in pediatric patients. .

OBJETIVO: Descrever a atividade antimicrobiana da defensina-beta 2 na glândula mamária e secretada no leite materno humano. MÉTODOS: A produção de peptídeos foi realizada por clonagem de DNA. Os níveis de defensina-beta 2 foram quantificados em 61 amostras de colostro e 39 de leite maduro de doadoras saudáveis pelo teste ELISA indireto. Por um ensaio de halo de inibição, avaliamos a atividade contra sete isolados clínicos diarreicos de crianças entre 0 e 2 anos. A atividade da defensina 2 contra três patógenos oportunistas que podem causar infecções nosocomiais foi determinada pelo teste de microdiluição. RESULTADOS: Os níveis de peptídeos estavam significativamente maiores nas amostras de colostro (n = 61) que de leite maduro (n = 39), como segue: 8,52 (2,6-16,3 µg/mL) mediana e faixa em comparação a 0,97 (0,22-3,78), p < 0,0001; teste de Mann-Whitney. O peptídeo recombinante foi obtido da alta atividade antimicrobiana demonstrada contra uma ampla gama de bactérias patogênicas. Sua atividade antibacteriana foi demonstrada em um disco contendo entre 1-4 µg, que produziu zonas de inibição entre 18 e 30 mm contra três isolados de Salmonella spp. e quatro de E. coli. A defensina-beta 2 demonstrou concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de 0,25 µg/mL e 0,5 µg/mL para S. marcescen and P. aeruginosa, ao passo que uma CIM maior (4 µg/mL) foi obtida contra um isolado de cepa multirresistente de A. baumannii. CONCLUSÕES: Até onde sabemos, este estudo é o primeiro a relatar níveis de defensina em mulheres da América Latina. A produção e a atividade da defensina 2 no leite materno comprovam sua importância como uma molécula de defesa para a saúde intestinal em pacientes pediátricos. .

Fatores microbiológicos e imunológicos envolvidos no desenvolvimento da cárie precoce da infância / Microbiological and immunological factors for the development of early childhood caries

A cárie precoce da infância (CPI) é ainda um grave problema de saúde pública no mundo, principalmente em países em desenvolvimento. Estudos têm sugerido a associação da ingestão frequente de carboidratos fermentáveis como a sacarose, altas contagens de microrganismos cariogênicos e maior vulnerabilidade imunológica da criança na etiologia da CPI. O objetivo deste estudo foi avaliar os aspectos microbiológicos e imunológicos associados ao desenvolvimento da cárie precoce da infância. Crianças com idade entre 36 e 60 meses foram selecionadas e divididas em três grupos: LC - livres de cárie, CPI e CPI-S (CPI-severa). Questionário sobre os aspectos socioeconômico-culturais, hábitos de higiene bucal e diários de dieta foram respondidos pelos responsáveis. Foram coletadas amostras de saliva e biofilme dental das crianças e processadas para subsequentes avaliações laboratoriais. Em seguida, os níveis de IgA salivar total e contra GbpB de S. mutans foram determinados por ELISA e Western blot, respectivamente, as concentrações salivares dos peptídeos catiônicos antimicrobianos (PCAM): defensinas hBD-2 e hBD-3, catelicidina LL-37 e histatina 5 (HTN-5) por ELISA e a presença e os níveis salivares de Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. e Scardovia wiggsiae por qRT-PCR, sendo que estes dados foram correlacionados com os níveis salivares e no biofilme dental de estreptococos mutans (SM) e Lactobacillus spp. por meio de cultivo em meios específicos. Os resultados mostraram que as crianças com CPI-S apresentaram menor renda familiar quando comparadas às crianças LC ou CPI. Contudo, a ingestão de açúcar não diferiu entre os grupos. O grupo CPI-S apresentou maior contagem de SM na saliva/biofilme em relação aos grupos LC e CPI. Houve uma correlação positiva entre a resposta de IgA contra GbpB e os níveis de SM, quando a população geral foi avaliada. Quando apenas crianças com altos níveis de SM foram comparadas, o grupo CPI-S...

Early childhood caries (ECC) is still a serious public health problem worldwide, especially in developing countries. Studies have been suggested the association among frequent intake of fermentable carbohydrates such as sucrose, high cariogenic microorganism’s counts and child’s immune vulnerability in the etiology of ECC. The objective of this study was to evaluate the microbiological and immunological factors for the development of early childhood caries. 36 to 60 monthold children were selected and distributed into three groups: caries free (CF), ECC and S-ECC (severe-ECC). Questionnaires about socio-economic-cultural data, oral hygiene habits and food-frequency diary were completed by the parents. Saliva and dental biofilm were collected from children and processed for subsequent laboratorial tests. The following analyses were determined: total IgA and IgA response against S. mutans GbpB by ELISA and Western blot, respectively; salivary concentrations of antimicrobial peptides (AMPs): defensins hBD-2 and hBD-3, cathelicidin LL-37 and histatin 5 (HTN-5) by ELISA; salivary detection and quantification of Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. and Scardovia wiggsiae by qRT-PCR, and these data were correlated with mutans streptococci (MS) and Lactobacillus spp. levels by culture in specific medium. Results showed that S-ECC children had reduced family income compared to ECC and CF. However, sugar intake did not differ among the groups. S-ECC group had higher MS count than CF/ECC groups. Positive correlations between salivary IgA response against GbpB and MS counts were found when the entire population was evaluated. When children with high mutans streptococci counts were compared, S-ECC group showed a significant decrease in IgA antibody levels against GbpB compared to CF group. This finding was not observed for ECC group. The present study showed positive correlations between salivary hBD-2 and HTN-5 with…

Fatores microbiológicos e imunológicos envolvidos no desenvolvimento da cárie precoce da infância / Microbiological and immunological factors for the development of early childhood caries

A cárie precoce da infância (CPI) é ainda um grave problema de saúde pública no mundo, principalmente em países em desenvolvimento. Estudos têm sugerido a associação da ingestão frequente de carboidratos fermentáveis como a sacarose, altas contagens de microrganismos cariogênicos e maior vulnerabilidade imunológica da criança na etiologia da CPI. O objetivo deste estudo foi avaliar os aspectos microbiológicos e imunológicos associados ao desenvolvimento da cárie precoce da infância. Crianças com idade entre 36 e 60 meses foram selecionadas e divididas em três grupos: LC - livres de cárie, CPI e CPI-S (CPI-severa). Questionário sobre os aspectos socioeconômico-culturais, hábitos de higiene bucal e diários de dieta foram respondidos pelos responsáveis. Foram coletadas amostras de saliva e biofilme dental das crianças e processadas para subsequentes avaliações laboratoriais. Em seguida, os níveis de IgA salivar total e contra GbpB de S. mutans foram determinados por ELISA e Western blot, respectivamente, as concentrações salivares dos peptídeos catiônicos antimicrobianos (PCAM): defensinas hBD-2 e hBD-3, catelicidina LL-37 e histatina 5 (HTN-5) por ELISA e a presença e os níveis salivares de Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. e Scardovia wiggsiae por qRT-PCR, sendo que estes dados foram correlacionados com os níveis salivares e no biofilme dental de estreptococos mutans (SM) e Lactobacillus spp. por meio de cultivo em meios específicos. Os resultados mostraram que as crianças com CPI-S apresentaram menor renda familiar quando comparadas às crianças LC ou CPI. Contudo, a ingestão de açúcar não diferiu entre os grupos. O grupo CPI-S apresentou maior contagem de SM na saliva/biofilme em relação aos grupos LC e CPI. Houve uma correlação positiva entre a resposta de IgA contra GbpB e os níveis de SM, quando a população geral foi avaliada. Quando apenas crianças com altos níveis de SM foram comparadas, o grupo CPI-S...

Early childhood caries (ECC) is still a serious public health problem worldwide, especially in developing countries. Studies have been suggested the association among frequent intake of fermentable carbohydrates such as sucrose, high cariogenic microorganism’s counts and child’s immune vulnerability in the etiology of ECC. The objective of this study was to evaluate the microbiological and immunological factors for the development of early childhood caries. 36 to 60 monthold children were selected and distributed into three groups: caries free (CF), ECC and S-ECC (severe-ECC). Questionnaires about socio-economic-cultural data, oral hygiene habits and food-frequency diary were completed by the parents. Saliva and dental biofilm were collected from children and processed for subsequent laboratorial tests. The following analyses were determined: total IgA and IgA response against S. mutans GbpB by ELISA and Western blot, respectively; salivary concentrations of antimicrobial peptides (AMPs): defensins hBD-2 and hBD-3, cathelicidin LL-37 and histatin 5 (HTN-5) by ELISA; salivary detection and quantification of Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. and Scardovia wiggsiae by qRT-PCR, and these data were correlated with mutans streptococci (MS) and Lactobacillus spp. levels by culture in specific medium. Results showed that S-ECC children had reduced family income compared to ECC and CF. However, sugar intake did not differ among the groups. S-ECC group had higher MS count than CF/ECC groups. Positive correlations between salivary IgA response against GbpB and MS counts were found when the entire population was evaluated. When children with high mutans streptococci counts were compared, S-ECC group showed a significant decrease in IgA antibody levels against GbpB compared to CF group. This finding was not observed for ECC group. The present study showed positive correlations between salivary hBD-2 and HTN-5 with…

Nanoencapsulação de um peptídeo isolado de anuros: citotoxicidade in vitro em células tumorais humanas / Nanoencapsulation of a peptide isolated from anurans: in vitro cytotoxicity in human tumor cells

A terapia antineoplásica tradicional apresenta algumas limitações que podem ser superadas através da utilização dos lipossomas. Estes nanossistemas de carreamento possibilitam o direcionamento de fármacos e reduzem efeitos secundários. Alguns peptídeos catiônicos sintetizados na pele de anuros apresentam atividade citotóxica seletiva (microorganismos e/ou tumores). Neste sentido, espécies do gênero Phyllomedusa secretam as dermaseptinas. Objetivou-se neste estudo, avaliar a citotoxicidade in vitro da dermaseptina 01 (DS 01) livre e encapsulada em lipossomas unilamelares pequenos (SUVs) em células tumorais humanas. Os lipossomas foram preparados pelo método de hidratação do filme lipídico seguido de sonicação. Foram produzidas formulações neutras e catiônicas, convencionais e furtivas. A citotoxicidade foi analisada em células tumorais de pulmão (NCI-H292), cólon (HT-29) e laringe (HEp-2), pelo ensaio de redução do sal tetrazólio (MTT) em placas de 96 poços. Os lipossomas foram submetidos a testes de estabilidade acelerada e em longo prazo. Em NCI-H292, a DS 01 livre apresentou efeito citostático médio de 35,6%. A encapsulação do peptídeo em lipossomas convencionais neutros aumentou o efeito, ao contrário dos furtivos. Para HT-29 e HEp-2, a DS 01 livre inibiu o crescimento celular em aproximadamente 50%, em média. A encapsulação em lipossomas catiônicos potencializou o efeito; os lipossomas convencionais inibiram na faixa de 80% e os furtivos, mais que 95% para as duas linhagens celulares. A DS 01, um peptídeo catiônico antimicrobiano, apresentou efeito citotóxico in vitro para células tumorais humanas que foi potencializado com a nanoencapsulação...

The conventional anticancer therapies show some limitations that can be overcome by using liposomes. This type of nanocarriers allows preferential targeting of drugs and reduces undesirable secondary effects. Some cationic peptides synthesized by the skin of anurans exhibit selective cytotoxicity (to pathogens and/or tumors). Species of Phyllomedusa secrete dermaseptins (DSs). The aim of this study was to assess the in vitro cytotoxicity of free and small unilamellar vesicle (SUV)-encapsulated dermaseptin 01 (DS 01) in various human tumor cells. Liposomes were prepared by lipid film hydration followed by sonication. Neutral and cationic, conventional and stealth liposomes were produced. Cytotoxicity was analyzed in lung (NCI-H292), colon (HT-29) and larynx (HEp-2) cancer cells, by the tetrazolium reduction method (MTT) carried out in 96-well microplates. Liposomes were tested for accelerated and long-term stability. In NCI-H292, free DS 01 showed a medium cytostatic effect of 36.5%. The conventional neutral liposome encapsulation of peptide increased this effect, whereas the stealth did not. In HT-29 and HEp-2, free DS 01 inhibited the cell growth by approximately 50% on average. The cationic liposome encapsulation was synergic, inhibition being about 80% in conventional and higher than 95% in stealth liposomes for both celllines. Thus, DS 01, an antimicrobial cationic peptide, showed in vitro cytotoxicity to human tumor cells that was potentiated by nanoencapsulation...