Implicancia de la inmunidad innata del epitelio bronquiolar en la modulación y prevención del asma / Implication of innate immunity in modulating bronchial epithelium and prevention of asthma

El asma alérgica ha incrementado su prevalencia, constituyéndose como un problema mundial de salud. Factores ambientales derivados de la vida moderna han sido vinculados a este fenómeno a través de la hipótesis de la higiene; la cual postula que la vida urbana disminuye la potenciación de la inmunidad innata, lograda a través del reconocimiento de estímulos microbianos por los receptores Toll-like (TLRs), conduciendo a la mayor prevalencia de respuestas alérgicas. Las investigaciones en asma en el último siglo han tenido como objetivo la disminución de la respuesta inmune adaptativa Th2 asociada a las alergias; sin embargo han conseguido escasos avances terapéuticos. Actualmente, es creciente el número de evidencias que implican a los componentes estructurales de la vía aérea en el inicio y progresión del asma; no obstante su rol en la prevención de la inflamación alérgica no ha sido suficientemente evaluado. Por lo tanto, el presente trabajo de Tesis Doctoral tuvo como objetivo general el estudio de la interacción de la inmunidad innata del epitelio bronquiolar y la inflamación alérgica del asma.

ABSTRACT: Recently, asthma rates have increased becoming a global health problem. The role of environmental factors in this increase, due to modern lifestyles, has been suggested by the hygiene hypothesis, which postulated that the urban hygienic conditions skip the early exposure to microbes hence that are clue to promote innate immune activation by signalling through the Toll-like receptors (TLRs) and thus preventing the allergic responses. Even though many investigations on asthma have been focused on the reduction of the allergic Th2-nflammatory response in the last century, the therapeutic advances have been scarce. Nowadays, there is increasing evidence of the involvement of the airway epithelial cells on the origin and progression of asthma. However, the role of these cells in preventing the triggering of allergic inflammation has not been evaluated. Therefore, the main objective of this thesis was to study the interaction of innate immunity of bronchiolar epithelium and allergic inflammation in asthma.

Modulation of thyroid hormone receptors, TRα and TRβ, by using different doses of triiodothyronine (T3) at different times / Modulação dos receptores de hormônio tireoidiano, TRα e TRβ, utilizando diferentes doses de triiodotironina (T3) em diferentes tempos

OBJECTIVE: To examine the effect of different doses of triiodothyronine (T3) on mRNA levels of thyroid hormone receptors, TRα and TRβ, at different times. MATERIALS AND METHODS: 3T3-L1 adipocytes were incubated with T3 (physiological dose: F; supraphysiological doses: SI or SII), or without T3 (control, C) for 0.5, 1, 6, or 24h. TRα and TRβ mRNA was detected using real-time polymerase chain reaction. RESULTS: F increased TRβ mRNA levels at 0.5h. After 1h, TRα levels increased with F and SI and TRβ levels decreased with SII compared with C, F, and SI. After 6h, both genes were suppressed at all concentrations. In 24h, TRα and TRβ levels were similar to those of C group. CONCLUSIONS: T3 action with F began at 1h for TRα and at 0.5h for TRβ. These results suggest the importance of knowing the times and doses that activate T3 receptors in adipocytes.

OBJETIVO: Examinar o efeito de diferentes doses de triiodotironina (T3) sobre a expressão gênica dos receptores TRα e TRβ em diferentes tempos. MATERIAIS E MÉTODOS: Adipócitos, 3T3-L1, foram incubados com T3 nas doses fisiológica (F, 10nM) e suprafisiológicas (SI, 100nM ou SII, 1000nM) ou veículo (controle, C) durante 0,5, 1, 6 ou 24h. mRNA dos TRs foram detectados utilizando PCR em tempo real. RESULTADOS: Níveis de TRβ aumentaram em F em 0,5h. Após 1h, níveis de TRα aumentaram em F e SI comparado ao C, enquanto TRβ diminuiu no SII comparado com C, F, e SI. Após 6h, ambos os genes foram suprimidos em todas concentrações. Em 24h, níveis de TRα e TRβ retornaram aos do C. CONCLUSÕES: Ação do T3 em F iniciou-se em 1h para TRα e 0,5h para TRβ. Esses resultados são importantes para determinar tempo inicial e dose de T3 em que os receptores de HT são ativados em adipócitos.

Recrutamento do complexo repressivo polycomb 2 pelo RNA não codificador longo antissenso ANRASSF1 modula a expressão do gene RASSF1A e a proliferação celular / Recruitment of polycomb repressive complex 2 by intronic long noncoding RNA ANRASSF1 modulates RASSF1A expression and cell proliferation

O gene supressor tumoral RASSF1A tem sido associado com redução da proliferação celular em diversos tumores. Sua expressão é regulada por eventos epigenéticos que envolvem o complexo repressivo polycomb (PRC2), no entanto os mecanismos moleculares da modulação do recrutamento deste modificador epigenético para este locus ainda são desconhecidos. Neste trabalho identificamos e caracterizamos ANRASSF1, um RNA não codificador longo (lncRNA) intrônico unspliced, que é transcrito na fita oposta do gene RASSF1A, em várias linhagem celulares e tecidos, e se liga a PRC2. ANRASSF1 é transcrito pela RNAPII, possui cap-5´ e cauda poli-A, além de localizar-se no núcleo e possuir uma meia-vida em média quatro vezes menor comparada com outros lncRNAs ligados à PRC2. A super-expressão ectópica de ANRASSF1 reduziu os níveis de RASSF1A e aumentou a taxa de proliferação em células HeLa, enquanto seu silenciamento provocou efeito oposto. Essas mudanças nos níveis de ANRASSF1 não afetaram a abundância da isoforma RASSF1C em nenhuma das condições. A super-expressão de ANRASSF1 provocou um grande aumento tanto da ocupação de PRC2 como da marca de histona repressiva H3K27me3 especificamente na região promotora RASSF1A. Nenhum efeito da super-expressão de ANRASSF1 foi detectado na ocupação de PRC2 e na histona H3K27me3 nas regiões promotoras de RASSF1C e de outros quatro genes vizinhos, incluindo dois genes supressores tumorais bem caracterizados. Além disso, foi demonstrado que ANRASSF1 forma um híbrido de RNA/DNA e recruta SUZ12, um componente do PRC2, para o promotor de RASSF1A. Notavelmente, foi detectado pelo ensaio de RNase-ChIP que a degradação de ANRASSF1 diminui a ocupação de PRC2 neste promotor. Esses resultados demonstram um novo mecanismo de repressão epigenética do supressor tumoral RASSF1A, envolvendo um lncRNA unspliced antissenso, onde ANRASSF1 reprime seletivamente a expressão da isoforma de RASSF1 que sobrepõe o transcrito antissenso de modo local e específico...

Tumor-suppressor RASSF1A gene down-regulation has been implicated in increasing cell proliferation in several tumors. Its expression is regulated by epigenetic events involving polycomb repressive complex 2 (PRC2), however the molecular mechanisms modulating recruitment of this epigenetic modifier to the locus remain largely unknown. Here, we identify and characterize ANRASSF1, an endogenous unspliced long noncoding RNA (lncRNA) that is transcribed from the opposite strand of RASSF1 gene in several cell lines and tissues, and binds to PRC2. ANRASSF1 is transcribed by RNA Polymerase II, 5'-capped, polyadenylated, displays nuclear localization, and has on average a four-fold shorter half-life compared to other lncRNAs that bind PRC2. ANRASSF1 ectopic overexpression decreases RASSF1A abundance and increases the proliferation rate of HeLa cells, whereas its silencing causes opposite effects. These changes in NRASSF1 levels do not affect RASSF1C isoform abundance. ANRASSF1 overexpression causes a marked increase both in PRC2 occupancy and in histone H3K27me3 repressive mark specifically at the RASSF1A promoter region. No effect of ANRASSF1 overexpression is detected on PRC2 occupancy and on histone H3K27me3 at the promoter regions of RASSF1C and of four other neighbor genes, including two well-characterized tumor suppressor genes. Additionally, we demonstrate that ANRASSF1 forms an RNA/DNA hybrid, and recruits SUZ12, a PRC2 component, to the RASSF1A promoter. Notably, depletion of ANRASSF1 disrupts SUZ12 occupancy on RASSF1A promoter as measured by RNAse-ChIP assay. Together, these results show a new mechanism of epigenetic repression of RASSF1A tumor suppressor gene involving an antisense unspliced lncRNA, in which ANRASSF1 selectively represses expression of the RASSF1 isoform overlapping the antisense transcript in a location-specific manner. In a broader perspective, our findings suggest that other non-characterized unspliced intronic lncRNAs transcribed in the...

Modulação redox da homeostase de células musculares lisas através de estimuladores do sistema NADPH oxidase / Redox modulation of smooth muscle cells homeostasis via inductors of NADPHoxidase system

As doenças cardiovasculares representam a principal causa de morte nos países ocidentais. Dentre essas doenças, a aterosclerose é que mais se destaca, sendo caracterizada pelo acúmulo de células musculares lisas vasculares (CMLV). O efeito patológico das CMLV em resposta a diferentes estímulos pode acarretar em disfunções nestas células. É notável que a aterosclerose ocorra principalmente em vasos sinuosos onde ocorre um forte turbilhonamento do fluxo sanguíneo, que pode acarretar em hemólise e, consequentemente, acúmulo de heme livre. Além disso, no processo de aterogênese as moléculas de adesão, principalmente integrinas, são de crucial importância durante a resposta de CMLV. Nesse trabalho nosso objetivo inicial foi avaliar o efeito do heme livre nas funções de CMLV, bem como os mecanismos moleculares por trás desses efeitos. Em uma segunda parte, investigamos o envolvimento da integrina α1ß1 no efeito da Angiotensina II (Ang II) em CMLV. Nós observamos que o heme livre é capaz de induzir a proliferação e migração de CMLV via espécies reativas de oxigênio (ERO) provenientes da NADPHoxidase (NADPHox). Adicionalmente vimos que o heme ativa vias de sinalização redox-sensíveis relacionadas à proliferação celular, como MAPKinases e o fator de transcrição NFκB. Também observamos que há uma ligação entre a NADPHox e o sistema heme oxigenase (HO), uma vez que o heme induz a expressão de HO-1 e o pré-tratamento das CMLV com inibidores de HO levam ao aumento tanto o efeito proliferação quanto a indução de ERO promovidas pelo heme. Além disso, vimos que o efeito contra-regulatório promovido pela HO ocorre devido as metabolites do heme: biliverdina, bilirrubina e monóxido de carbono. Por último, quando bloqueamos tanto a NADPHox quanto o sistema HO o heme não teve efeito algum na proliferação de CMLV...

Cardiovascular diseases represent the major mortality reason in western countries. Among these diseases, atherosclerosis is the most prominent one, which is characterized by vascular smooth muscle cell (VSMC) accumulation. The pathological effect of VSMC in response to different stimuli is able to induce VSMC dysfunctions. Notably, this cardiovascular disease occurs mainly in sinuous vessels with turbulent blood flow, which may lead to hemolysis and consequent free heme accumulation. Furthermore, in atherogenesis the adhesion molecule, mainly integrins, were of crucial importance during the VSMC response. In this work our aim was to elucidate the effect of free heme in VSMC, as well the molecular mechanisms underlying this process. In a second part, we investigated the role of α1ß1 integrin in Angiotensin II (Ang II) effect on VSMC. We observed that free heme is able to induce VSMC proliferation in a Reactive Oxygen Species (ROS) derived from NADPHoxidase (NADPHox) dependent manner. Additionally, heme activates proliferation-relationed redox-sensitive signaling routes, such as MAPKinases and the transcription factor NFκB. It was also observed a critical crosstalk between NADPHox and heme oxygenase (HO) system, once heme induces HO-1 expression and VSMC pretreatment with HO inhibitors increased heme proliferative effect and ROS production. Accordingly, we observed that the counter-regulatory effect promoted by HO occurs due heme metabolites: biliverdin, bilirubin and carbon monoxide. Finally, when both NADPHox and HO system were blocked, heme had no effect on VSMC proliferation...

Modulação da resposta imune em pacientes portadores de queilite actínica e carcinoma espinocelular de boca / Modulation of immune response in patients with actinic cheilitis and oral squamous cell carcinoma

Programmed death-1 (PD-1) é uma proteína de membrana que funciona como um importante regulador negativo da atividade de linfócitos ativa dos, participando, desta forma, do delicado balanço entre ativação e tolerância de células T. Dados recentes têm evidenciado que os mecanismos de tolerância periférica, mediados pela interação PD-1/PD- L1, também impedem uma resposta imune antitumoral eficaz, mesmo em condições nas quais os antígenos tumorais possam ser reconhecidos. Apesar de crescentes evidências demonstrarem o papel da via PD-1 no escape tumoral, pouco se sabe a respeito do seu significado em tumores da cavidade oral. Sabe-se menos ainda sobre a expressão desta molécula em lesões orais pré-neoplásicas. Baseado no exposto, o presente estudo analisou a expressão de PD-1 e seu ligante PD-L1 em lesões de queilite actínica e carcinoma espinocelular de boca através de citometria de fluxo e imunomarcação in situo Os resultados obtidos demonstraram que as células isoladas do sangue periférico e de lesões de queilite actínica e carcinoma espinocelular oral apresentam expressão aumentada de PD-1. A expressão de PD-L1 é mais restrita em queilite actínica, porém é intensa em carcinoma espinocelular oral.

Programmed death-1 (PD-l) is a transmembrane protein that acts as a negative regulator in effector T cells, modulating the delicate balance between effective antimicrobial immune defenses and immune-mediated tissue damage. However, recent evidences suggest that the PD-l: PD-L1 pathway can also block antitumor immune responses even when tumor antigens can be recognized. In spite of growing data indicating the involvement of PD-l in tumor escape, little is known about its role in tumors of oral cavity. In addition, the involvement of PD-l in pre-malignant lesions is an important issue to be clarified. In the present work we investigated the expression of PD-l and PD-L1 in blood and biopsies of patients with actinic cheilitis and oral squamous cell carcinoma by flow cytometry, immunofluorescence and immunohistochemistry. Our data showed that Iymphocytes obtained from peripheral blood and lesion sites exhibited high expression of PD-l in both groups studied Moreover, PD-L1 expression was intense in oral squamous cell carcinoma and moderate in actinic cheilitis.

Componente neural/endócrino no granuloma e modulação fenotípica mesenquinal/neural das células estrelares hepáticas na infecção esquistosomótica murina / Endócrino neural component in granuloma and neural mesenquinal fenotípica modulation of the Liver cells strelars in the murina esquistosomótic infection

A formação e modulação do granuloma não dependem apenas de mecanismos imunológicos extrínsecos, como é tradicionalmente considerado. O granuloma é uma estrutura complexa, com mecanismos reguladores intrínsecos, ainda pouco conhecidos, que compreendem a produção interna de citocinas, neuropeptídeos, adipocinas e conseqüente ativação de células estrelares hepáticas (HSCs). Então, propôs-se como objetivo estudar in situ o componente neuroendócrino do granuloma esquistossomótico hepático, verificando a modulação dos fenótipos mesenquimal e neural/endócrino das HSCs em diferentes tempos da infecção por S. mansoni (30, 45, 60, 90, 120,150 e 180 dias). Camundongos Swiss Webster foram submetidos à eutanásia (de acordo com as normas do comitê de ética de uso de animais- CEUA- Fiocruz). Espécimes de fígado obtidos durante a necropsia foram congeladas em nitrogênio e seccionadas em criostato (5um) e submetidas à imunofluorescência para microscopia confocal, aplicando anticorpos primários para fenótipos de células estrelares hepáticas, leptina e seu receptor e neuropeptídeos

Os resultados revelaram a presença de neuropeptídeos (substância P, somatostatina e sinaptofisina) em distintas zonas do granuloma exsudativo-produtivo. Além disso, as HSCs foram evidenciadas com esses mesmos marcadores, além da expressão do filamento protéico glial acídico (GFAP), em granulomas das fases mais crônicas e no parênquima. Leptina e seu receptor se expressavam em distintos estágios da granulomatogênese. O granuloma, apesar de não ser inervado, expressa intensamente vários neuropeptídeos e adipocinas e mostra em sua composição HSCs com fenótipo neural/neuroendócrino, indicando a presença intrínseca de circuitos neuroendócrinos pouco conhecidos, que, junto com mecanismos imunológicos, participam em sua regulação ou modulação. Além disso, a presença de marcadores específicos do sistema nervoso, como GFAP, sinaptofisina e neurotrofinas no granuloma esquistosomótico e em HSCs dispersas pelo parênquima, reforçam a concepção atual do fígado como um importante ambiente neuroendócrino.

Obtenção de células com propriedades imunomoduladoras in vitro: avaliação preliminar dos efeitos de anticorpos anti-CD4 e de cultivo celular prolongado / Attainment of cells bearing in vitro immunomodulatory properties: preliminary observations on the effects of anti-CD4 antibodies and long-term cell culture

A indução de tolerância por anticorpos anti-CD4 tem sido descrita em modelos animais in vivo e existem relatos de seu uso experimental em seres humanos. Métodos para obter resultados semelhantes com um tratamento in vitro poderiam evitar graves efeitos colaterais e viabilizar a sua aplicação a um número maior de pacientes. Contudo, efeitos modulatórios de anticorpos anti-CD4 sobre a resposta de células T in vitro ainda não foram descritos. Neste trabalho, ensaios de reação mista linfocitária foram usados para testar a resposta de células do baço de camundongos à estimulação por aloantígenos e por um superantígeno em presença do anticorpo monoclonal anti-CD4 YTS177. 9. Em ambos os casos, o uso deste anticorpo reduziu a proliferação induzida pelo antígeno. Células de baço previamente cultivadas por dez dias na presença de antígeno, com e sem anti-CD4, foram capazes de inibir a proliferação de células idênticas não tratadas, em resposta ao mesmo antígeno. A adição de anti-CD4 ao cultivo exacerbou o efeito inibidor, de maneira dose-dependente. Estes efeitos não puderam ser verificados em um cultivo semelhante realizado por três dias, devido à intensa proliferação residual a este tempo. Estes resultados indicam um efeito modulatório in vitro de anticorpos anti-CD4 sobre esplenócitos de camundongos e podem representar a primeira evidência de tolerância dominante induzida por anticorpos in vitro.

La célula de Langerhans / Langerhans cell

La célula de Langerhans es una presentadora de antígenos profesional que juega un papel clave en el inicio y en la regulación de la respuesta inmune. Se localiza en la epidermis y en otros epitelios estratificados desde donde emigra a los órganos linfoides secundarios para presentar a los linfocitos T aquellos antígenos que penetran por la piel e iniciar la respuesta inmune específica. Presentamos una serie de imágenes de microscopía de luz y electrónica de estas células tal y como se encuentran en la epidermis y su morfología después de emigrar al medio de cultivo. Se reseñan algunos factores que inducen su migración, así como los usos terapéuticos potenciales como moduladoras de la respuesta inmune, ya sea para generarla, como en el caso del tratamiento del melanoma; aumentarla, en infecciones causadas por microorganismos intracelulares, o evitarla para el tratamiento de alergias.

Terapia biológica en artritis reumatoide / Biologic theraphy in rheumatoid arthritis

La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune de causa desconocida que afecta aproximadamente al 2 por ciento de la población económicamente activa, por lo cual representa un problema de salud pública. El tratamiento con drogas citotóxicas ha permitido mejorar la calidad de vida de estos pacientes; sin embargo todavía existe un número importante que no responde o que tiene poca tolerancia a esta modalidad de tratamiento. El avance de la biotecnología ha permitido el surgimiento de una nueva modalidad de tratamiento conocida como terapia biológica; la cual ha creado expectativas interesantes sobre su efecto en pacientes con artritis reumatoide. El objetivo de esta publicación, es revisar las diferentes modalidades de esta terapia y los resultados iniciales en pacientes con artritis reumatoide.

Modulação do granuloma periovular esquistossomótico: morfometria e comportamento da matriz extracelular / Periovular schistosomal granuloma modulation: morphology and behavior of the extracellular matrix

O granuloma formado em torno de ovo maduro do Schistosoma mansoni no fígado se modifica no seu tamanho, forma e composição com o passar do tempo. Este fenômeno,denominado "modulação imunológica", tem sido atribuído fundamentalmente a fatores imunes. Como a "modulação" ocorre apenas no fígado, e não em outros órgãos, a participação de fatores locais parece ser decisiva para que o fenômeno ocorra. Estes últimos têm sido pouco estudados e agora, numa tentativa de contribuir para o seu entendimento, foram particularmente considerados. A presente investigação foi feita em camundongos infectados com 50 e 100 cercárias do S. mansoni. Os granulomas formados em torno de ovos madurosforam estudados e comparados em três órgãos (pulmão, fígado e intestino) e em três fases distintas da infecção: aguda (8 semanas), intermediária (16 semanas) e crônica (22 semanas), com técnicas histológicas, morfométricas, bioquímicas e de imuno-fluorescência. Os resultados confirmaram que o fenômeno da modulação é exclusivamente hepático, não sendo observadas modificações semelhantes no pulmão e intestino. Os elementos da matriz extracelular pesquisados (colágenos de tipo I, lU e IV, fibronectina, laminina, proteoglicanos e elastina) estiveram presentes em todos os locais, mas eram muito mais proeminentes no fígado. Exceto a elas tina, que apareceu apenas no fígado, exclusivamente em casos crônicos. A avaliação morfométrica indicou redução no volume, área e densidade de volume apenas nos granulomas hepáticos ao longo das três fases estudadas. A abundância de elementos da matriz extracelular presente nos granulomas hepáticos foi a principal alteração responsável pelos aspectos morfológicos da modulação. Esse aspecto foi correlacionado com particularidades da estrutura celular não parenquimatosa do fígado, onde as células perinusoidais e as células de Kupffer participam de um eixo "sui generis" relacionado com a formação e degradação da matriz. No estudo do fenômeno da "modulação" do granuloma esquistossomótico fica evidente que é o comportamento destes elementos celulares que determina as modificações da matriz extra-celular em torno dos granulomas hepáticos, representando, na sua essência, o fenômeno da "modulação".

Evidentiation of paramyosin (Sm-97) as a modulating antigen on granulomatous hypersensitivity to Schistosoma mansoni eggs

A Schistosoma mansoni adult worm anionic fraction (PIII) has previously been shown to protect mice against challenge infection and to reduce pulmonary and hepatic granulomatous hypersensitivity. Serum from PIII-immunized rabbit was used to screen a gt11 cDNA library from S. mansoni adult worm in order to identify antigens capable of modulating granulomatous hypersensitivity. We obtained four clones with 400 (Sm-III.11), 900 (Sm-III.16), 1100 (Sm-III.10) and 1300 (Sm-III.12) bp of length. All clone-specific antibodies were able to recognize most of the PIII components. The sequence analysis showed that these clones presented high homology with S. mansoni paramyosin (Sm-97). These findings describe a new function to this antigen with an important role in modulation of granulomatous hypersensitivity to S. mansoni eggs.

Múltiples estrategias de evasión de la respuesta inmune por citomegalovirus humano: Mecanismos moleculares / Multiple estrategies of the immune response by human cytomegalovirus. MHC down-regulation

El citomegalovirus humano (HCMV), miembro de la familia de los herpevirus, es un patógeno ubicuo importante en individuos inmunosuprimidos y/o inmunológicamente inmaduros. El balance global en la relación huéspedd-virus depende del estado del sistema inmune, el cual contribuye a través de varios mecanismos efectores al control viral. Después de la primoinfección, aún los individuos inmunocompetentes son incapaces de erradicar al virus debido al establecimiento de un estado de persistencia viral que es resultado del desarrollo de múltiples estrategias de evación al sistema inmune, entre las que se incluyen el ocultamiento viral, el efecto de suspresión inmune y la interferencia a los proceso naturales de presentación de antígeno. Probablemente el mecanismo más relevante para el éxito de la infección viral sea la evasión de la respuesta inmune mediada por células, a través de la disminución de la expresión de moléculas de histocompatibilidad en las células infectadas

Environmental changes and cellular responses Part v decisive cellular responses and inevitability of diseases

Antigens present on the cell membranes perceive all kinds of environmental information necessary for the proper physiology of the cell. Deletion or blocking of one group of these receptors leads to the disturbance of the corresponding biological process which may lead to manifest clinical disease. Imperfect synthesis of a small amount of an antigen leads to inevitable production of auto-antibodies that may-cross react with the proper perfectly synthesized antigen resulting in the occurrence of auto-immune disease. Complete deletion or blocking of a group of antigens responsible for perceiving the information required for the proper proliferation, of certain cells [by viruses or chemicals or specific antibodies leads to uncontrolled proliferation of these cells. The active genes and their antigens determine the cell responses. Thus, the responses of each individual are decisive. Abnormalities in the genes and/or their antigens lead to morbid physiology that may result in inevitable clinical diseases