Identificação das proteínas interagentes de Yes-Associated protein (YAP), um efetor da via Hippo, em células epiteliais mamárias expostas à matriz extracelular rica em laminina / Identification of interacting proteins of Yes-Associated Protein (Yap) in mammary epithelial cells exposed to laminin-rich extracellular matrix

A sinalização da matriz extracelular (MEC) é essencial para a determinação do destino e comportamento de células epiteliais da glândula mamária. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo. A via Hippo, uma cascata de sinalização que participa da regulação de diversos comportamentos celulares, incluindo o tamanho de órgãos, parece ser uma importante candidata a mediadora sinalização da MEC. Resultados preliminares do laboratório indicam que a arquitetura tecidual e a membrana basal, componente da MEC de epitélios e outros tecidos, influenciam a localização, concentração e atividade de YAP, uma proteína efetora da via Hippo, em células epiteliais mamárias. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi identificar as proteínas que interagem com Yap (ortólogo de YAP em camundongo) nas células epiteliais da glândula mamária em resposta à membrana basal. Foram utilizadas células EpH4, uma linhagem mamária não-tumoral murina, como modelo de diferenciação funcional e formação de ácinos em um ensaio de cultura tridimensional (3D). O tratamento de estruturas multicelulares 3D pré-formadas em placas nãoadesiva com uma matriz rica em laminina (lrECM) alterou a localização e o padrão subcelular de Yap, assim como a expressão gênica de membros da via Hippo e dos alvos de Yap, mas não alterou a expressão das proteínas da via em nível de proteína. O ensaio de co-imunoprecipitação (CoIP) seguida de análise por espectrometria de massas identificou um conjunto diferencial de proteínas que interagem com Yap na fração citoplasmática de células EpH4 cultivadas na ausência ou na presença de lrECM em um modelo de ECM-overlay. Uma análise realizada junto à database KEGG Pathways revelou que os possíveis interagentes Yap nas células cultivadas não-tratadas com lrECM participam de processos relacionados à proteólise mediada por ubiquitina, enquanto nas células expostas à lrECM os possíveis interagentes estão associados a processos metabólicos e são especialmente proteínas-chave do metabolismo de lipídios. A busca na plataforma de redes de interação STRING não identificou trabalhos que destaquem a interação de Yap com estas proteínas. A plataforma Vizit indica a participação de Yap em processos relacionados à síntese e atividade de lipídios e hormônios, o que reforça as evidências de que está pode ser uma nova função de Yap ainda não explorada em detalhes. A fim de se obter resultados complementares à CoIP, padronizamos o ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade (BioID) em células embrionárias de rim humano da linhagem 293FT. As proteínas isoladas por pulldown foram identificadas por espectrometria de massas e uma análise junto à database Gene Ontology indicou que os possíveis interagentes de Yap nestas células são em sua maioria proteínas relacionadas à via Hippo, o que reforça a robustez do ensaio. Nós pretendemos transpor este sistema para as células EpH4. A expectativa é que, em conjunto, estes resultados nos orientem em projetos futuros para compreender os mecanismos de sinalização da MEC na morfogênese e diferenciação da glândula mamária

Extracellular matrix (ECM)-signaling is crucial for determination of epithelial cell fate and behavior in the mammary gland. However, little is known about the molecular mechanisms involved in these processes. The Hippo pathway, a signaling cascade involved in the regulation of several cellular processes, including organ size, seems to be an important candidate as a mediator of this signaling. Our preliminary results indicate that the tissue architecture and the basement membrane, an ECM component of epithelia and other tissues, influence the location, level and activity of YAP, an effector of the Hippo pathway. In this context, the goal of this work was to identify the proteins that interact with Yap (ortholog of YAP in mouse) in mammary epithelial cells in response to the basement membrane. We used EpH4 cells, a nontumoral murine mammary cell, in a functional differentiation and acini-forming in tridimensional (3D) culture assay. Treatment of 3D multicellular structures pre-formed on nonadhesive plates with a laminin-rich extracellular matrix (lrECM) altered the subcellular localization and pattern of Yap, as well as gene expression of Hippo pathway proteins and Yap targets, but did not altered the expression of the pathway members at the protein level. Coimmunoprecipitation (CoIP) followed by mass spectrometry analysis identified a differential set of proteins interacting with Yap in cytoplasmic fractions of EpH4 cells in the absence or presence of lrECM in an ECM-overlay culture model. An analysis performed with the KEGG Pathways database revealed that putative Yap interactors in non-treated cells participate in processes related to ubiquitin-mediated proteolysis, whereas in cells exposed to lrECM Yap interactors are associated to metabolic processes and are mainly key-proteins of metabolism of lipids and carbohydrates. A search in interaction networks platform STRING did not identify previous works that showing the interaction of Yap with these proteins. Vizit platform indicated the participation of Yap in processes related to the synthesis and activity of lipids and hormones, which reinforces the evidences that Yap can play a novel poorly explored role. To obtain complementary results to CoIP, we devised the proximity-dependent biotinylation identification (BioID) assay on embryonic renal cells of 293FT cell line. Pulldown-isolated proteins were identified by mass spectrometry and an analysis performed with Gene Ontology database revealed that putative Yap interactors are Hippo pathway-related proteins, which reinforces the robustness of the assay. We intend to transpose this system to the EpH4 cells. We expect that, together, these results will guide us in future projects to understand the signaling mechanisms of ECM in mammary gland morphogenesis and differentiation

Histologic alterations of the basement membrane of the dermal and epidermal layers of the hoof in horses with acute laminitis

Fueron estudiadas las características morfológicas de los cascos de dos grupos de equinos. El primer grupo, conformado por cinco animales adultos, sin ninguna alteración clínica, correspondió al grupo control. El siguiente grupo, constituido por siete equinos recibieron 17,6g/kg de carbohidratos por vía oral, para la inducción de laminitis. De este grupo, 71 por ciento desarrolló la sintomatología entre 36 y 48 horas después de la administración del carbohidrato. Pasadas 48 h de la inducción de laminitis, los animales fueron sacrificados y sus miembros fueron retirados para realizar los respectivos estudios histológicos. Se efectuaron cortes histológicos de 5 a 7µm de grosor y, posteriormente, se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE) y ácido peryódico de Schiff (PAS) para ser sometidos a microscopía óptica. A través de la coloración de HE, fue posible determinar alteraciones en la arquitectura de las láminas epidérmicas primarias y secundarias, las cuales se presentaron delgadas y anchas, con los núcleos de las células basales de forma arredondada y, eventualmente, localizados en su polo basal. La coloración por el PAS, permitió observar la membrana basal y la matriz proteica, separando las láminas epidérmicas y dérmicas y definiendo la morfología de éstas. En los equinos del grupo con laminitis se observaron deformación y fragmentación de la membrana basal. La utilización del PAS permitió determinar las alteraciones degenerativas graves en la membrana basal, de presentación precoz y coincidiendo con el desarrollo de los signos clínicos de claudicación.

Análisis de la distribución de los componentes de membrana basal laminina, fibronectina y colágeno IV en vasos sanguíneos de patología mamaria benigna y maligna / Analysis of the distribution of components in basal membrane laminin, fibronectin and type IV collagen in blood vessels of benign and malignant mammary pathology

Dentro de la compleja y aún poco comprendida biología de la formación de neovasos en tumores malignos se ha establecido que uno de los puntos restrictivos del proceso sería la precoz destrucción y remodelación que sufre la membrana basal perivascular, la cual estaría mediada por la activación de metalloproteinasas de matriz extracelular. Las diferencias en la cantidad y potencia de los distintos mediadores podrían traer como resultado un cambio en los patrones normales de distribución, cantidad y calidad de los componentes de membranas basales perivasculares en tejidos afectados por neoplasias respecto de lo que existe en la mama normal o en patologías benignas. Se estudiaron 118 piezas histológicas de patología mamaria entre 1990-2000. Se realizaron inmunomarcaciones con anticuerpos primarios antilaminina, fibronectina y colágeno de tipo IV para estudiar membrana basal perivascular. La cantidad de componentes de membrana basal de los vasos sanguíneos aumentan cuando una patología mamaria pasa de ser localizada a invasora y también a medida que se va perdiendo el grado de diferenciación histológica de las mismas. Las características moleculares de las membranas basales vasculares son diferentes en el tejido correspondiente a carcinomas mamarios invasores respecto de lo observado en tejido normal o en patologías sin disrupción de la membrana basal.

Estudio anatómico y radiográfico del conducto dentario inferior / Anatomical and radiographic study of the inferior dental nerve

En la práctica odontológica es fundamental el conocimiento de la anatomía de la zona a trabajar, para poder realizar terapéuticas exitosas sin causar daños irreparables a los tejidos u órganos vecinos a las piezas dentarias. Dentro de estos reparos anatómicos, encontramos en el maxilar superior al seno maxilar o antro de Highmore y a las fosas nasales, mientras que en el maxilar inferior al conducto dentario inferior. Muchos tratamientos, tales como cirugía, endodoncia, implantología, hacen que cuando el odontólogo trabaje en el maxilar superior como en el inferior, tenga presente que los ápices dentarios se encuentran separados de las zonas anteriormente citadas, por tabiques óseos extremadamente delgados, como sucede con el hueso interapicosinusal, que si bien sirven de barrera fisiológica entre ellos, su alteración por maniobras inadecuadas, los puede complicar, invadiéndolos. Por otro lado, es bien sabido que la ausencia de las piezas dentarias por agenesia o por acción de la placa bacteriana, causando caries o enfermedad periodontal, produce la reabsorción de la apófisis alveolar, ya que ésta existe sólo con la presencia de la pieza que aloja, ocasionando dicha reabsorción el acercamiento del reborde alveolar residual en el maxilar superior al seno maxilar y a las fosas nasales, determinando la aparición de los huesos interbucosinusal e interbuconasal, respectivamente, y en el maxilar inferior el conducto dentario inferior

Expressäo de colágeno IV e laminina urinários no diabetes mellitus induzidopor drogas (aloxana e estreptozotocina) e avaliaçäo morfo-funcional renal

Resumo: A excreçäo urinária de componentes da mebrana basal, específicamente colágeno IV e laminina, foi determinada através de "immunoblotting", e estudada em ratos Wistar machos, diabéticos-induzido por drogas (aloxana e estreptozotacina)EV, e comparada a controles, em funçäo do tempo de doença. Estudamos, também, as funçöes renais: gloerular e tubular, avalinado, respectivamente, clearance de creatina e de lítio. Além disso, aspectos morfológicos renais foram analizados utilizando-se técnicas de PAS e de imuno-histoquímica, para colágeno IV e laminina, com o objetivo de verificar possíveis alteraçöes da membrana basal. Assim pudemos obeservar excreçöes de fraçöes urinárias de colágeno IV (88 e 75 kDa) e laminina (108 a 88 kDa), em ambos os modelos de DM, em todos os tempos estudados . Entretanto, a fraçäo de 57 kDa da laminina, nos animais diabéticos-induzido por estreptozotocina, somente foi expressa a partir da quinta semana da doença, enquanto nos diabéticos-induzidopor aloxana sua excreçäo foi verificada precocedente (segundo dia). As alteraçöes da funçäo renal foram semelhantes nos dois modelos, porém de maneira mais intensa no modelo aloxânico. Dentre elas destacaram-se: diminuiçäo progressiva da taxa de filtraçäo glomerular, aumento da fraçäo de escreçäo de sódio;e, dimuiçäo da reabsorçäo deste íon, näo compensada por aumento da reabsorçäo distal.

Estudo imuno-histoquímico do colágeno IV da membrana basal no carcinoma do colo uterino / Collagen IV of basement membrane in carcinoma of uterine colon immunohistochemical study

A integridade da membrana basal (MB) está comprometida no processo de evoluçäo de uma lesäo benigna ou potencialmente maligna para uma lesäo maligna, onde ela pode sofrer graus variados de descontinuidade como condiçäo necessária ao processo de invasäo. A imunocoloraçäo para colágeno IV, componente encontrado exclusivamente na MB, tem sido utilizada para avaliar os padröes de apresentaçäo da mesma em neoplasias e lesöes benignas de vários órgäos. Com o objetivo de avaliar o padräo de continuidade da MB em Carcinomas "in situ" (CIS), microinvasivos (CMI) e epidermóides francamente invasores (CEI) do colo uterino, bem como o de verificar o possível auxílio de tal expressäo no diagnóstico de invasäo inicial do estroma (CMI), realizou-se aqui um estudo retrospectivo em casos diagnosticados no Departamento de Anatomia Patológica da UNICAMP entre 1988 a 1993. Os casos selecionados, previamente fixados e incluídos em parafina, foram revistos (hematoxilina-eosina) e posteriormente submetidos a estudo imuno-histoquímico pelo método da avidina-biotina-peroxidase com anticorpo monoclonal produzido em camundongo anticolágenmo IV (Dakopatts). Os cortes histológicos foram previamente submetidos à digestäo por pepsina durante 2 horas a 37oC. Ao final da seleçäo foram avaliados 20 casos de CIS, 15 de CMI e 24 de CEI. Os casos de CEI mostraram evidente descontinuidade, em grau pequeno ou grande da MB (23/24 asos), mostrando apenas um caso com MB contínua e íntegra. Embora näo houvesse significância estatística no padräo de continuidade da MB entre casos de CIS e CMI, houve nítida tendência destes a apresentarem pequenas interrupçöes (7 de 15 casos de CMI contra apenas 3 de 20 casos de CIS). O infiltrado inflamatório, variável também analisada, näo deveria ser responsabilizado pelas áreas de descontinuidade da MB, uma vez que näo houve correlaçäo estatística entre elas. Em 15 dos 59 casos estudados houve algum grau de discordância, quer à revisäo da morfologia ou após avaliaçäo da imunocoloraçäo. Estes casos foram submetidos a um segundo revisor, sendo que em 8 casos a imunocoloraçäo foi importante na decisäo diagnóstica. Em outros cinco, porém, a imunocoloraçäo mostrou-se falha, pois o processo patológico analisado havia sido desbastado do bloco de parafina. Os resultados do presente trabalho sobre o padräo de continuidade da MB säo compatíveis com os dados da literatura. Concluiu-se que a imunocoloraçäo para colágeno IV pode ajudar o diagnóstico de invasäo inicial do estroma (CMI), contudo, a avaliaçäo deve ser criteriosa e feita em conjunto com os dados de morfologia clássica