A map of neutrophil granules by proteomics / Mapa dos neutrófilos por proteômica (OU) Mapa dos grânulos do neutrófilo por proteômica

Neutrophils are polymorphonuclear leukocytes that play a key role in the organism defense. These cells enroll in a range of actions to ensure pathogen elimination and orchestrate both innate and adaptative immune responses. The main physiological structures of neutrophils are their storage organelles that are essential since the cells activation and participate in all their functions. The storage organelles are divided into 2 types: granules and secretory vesicles. The granules are subdivided into azurophilic, specific and gelatinase. The granules are distinguished by their protein content, and since they play an important role on the neutrophil function, the knowledge of the proteins stored in these organelles can help to better understand these cells. Some proteins are present in high abundance and are used as markers for each storage organelle. These proteins are myeloperoxidase (MPO) for azurophil granules, neutrophil gelatinase associated with lipocalin-2 (NGAL) and lactoferrin (LTF) for specific granules, matrix metalloproteinase-9 (MMP9) for gelatinase granules and alkaline phosphatase (AP) for secretory vesicles. The isolation of neutrophils granules, however, is challenging and the existing procedures rely on large sample volumes, about 400 mL of peripheral blood or 3 x 108 neutrophils, not allowing for multiple biological and technical replicates. Therefore, the aim of this study was to develop a miniaturized neutrophil granules isolation method and to use biochemical assays, mass spectrometry-based proteomics and a machine learning approach to investigate the protein content of the neutrophils storage organelles. With that in mind, 40 mL of the peripheral blood of three apparently healthy volunteers were collected. The neutrophils were isolated, disrupted using nitrogen cavitation and organelles were fractionated with a discontinuous 3-layer Percoll density gradient. The presence of granules markers in each fraction was assessed using western blot , gelatin zymography and enzymatic assays. The isolation was proven successful and allowed for a reasonable separation of all neutrophils storage organelles in a gradient of less than 1 mL, about 37 times smaller than the methodsdescribed in the literature. Moreover, mass spectrometry-based proteomics identified 369 proteins in at least 3 of the 5 samples, and using a machine learning strategy, the localization of 140 proteins was predicted with confidence. Furthermore, this study was the first to investigate the proteome of neutrophil granules using technical and biological replicates, creating a reliable database for further studies. In conclusion, the developed miniaturized method is reproducible, cheaper, and reliable. In addition, it provides a resource for further studies exploring neutrophil granules protein content and mobilization during activation with different stimuli

Neutrófilos são leucócitos polimorfonucleares que possuem papel fundamental na defesa do organismo. Essas células desempenham diversas ações a fim de assegurar a eliminação de um patógeno e, além disso, orquestram a resposta imune inata e adaptativa. O conjunto composto pelos grânulos de armazenamento e as vesículas secretórias compõe a principal estrutura fisiológica dos neutrófilos. Estes componentes são essenciais desde a ativação celular, participando de todas as funcionalidades desta célula. Os grânulos são subdivididos em azurófilos, específicos e gelatinase. Eles podem ser distinguidos por meio de seu conteúdo proteico e, como são importantes na funcionalidade dos neutrófilos, identificar quais proteínas são armazenadas nestas organelas é imprescindível para entender melhor essa célula como um todo. Algumas proteínas, estão presentes de forma abundante e, portanto, são utilizadas como marcadores dos grânulos. Tais proteínas são mieloperoxidase (MPO) para os grânulos azurófilos, gelatinase de neutrófilo associada a lipocalina (NGAL) e lactoferrina (LTF) para os específicos, metaloproteinase de matrix 9 (MMP9) para os grânulos de gelatinase e fosfatase alcalina (AP) para as vesículas secretórias. Isolar estas estruturas, no entanto, é desafiador visto que os protocolos existentes na literatura utilizam grandes volumes de amostra, cerca de 400 mL de sangue ou 3 x 108 neutrófilos, para apenas um isolamento, impedindo a realização de replicatas técnicas e biológicas. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi desenvolver um protocolo miniaturizado de isolamento dos grânulos neutrofílicos e utilizar métodos bioquímicos, de proteômica e machine learning para investigar o conteúdo proteico destas estruturas celulares. Para isto, 40 mL de sangue periférico de três voluntários aparentemente saudáveis foi coletado. Os neutrófilos foram então isolados, lisados com cavitação de nitrogênio e o fracionamento subcelular foi realizado baseado em um gradiente descontínuo de 3 camadas de Percoll. O método de isolamento foi avaliado através da investigação dos marcadores utilizando western blotting (WB), zimografia de gelatina e ensaios enzimáticos em cada fração coletada. O isolamento demonstrou-se eficiente e permitiu uma ótima separação dos grânulosem um gradiente menor que 1 mL, cerca de 37 vezes menor que os métodos atualmente descritos na literatura. Além disso, a análise proteômica foi capaz de identificar 369 proteínas presentes em pelo menos 3 das 5 réplicas investigadas e, utilizando ferramentas de machine learning, 140 proteínas foram classificadas como pertencentes a um dos tipos de grânulos ou vesícula secretória com alto nível de confiabilidade. Por fim, o presente estudo foi o primeiro a investigar o proteoma dos grânulos utilizando replicatas técnicas e biológicas, criando e fornecendo uma base de dados robusta que poderá ser utilizada em estudos futuros. Conclui-se, portanto, que a metodologia miniaturizada desenvolvida é eficaz, reprodutível e mais barata, além de permitir estudos mais complexos e profundos sobre o proteoma dos grânulos dos neutrófilos em diferentes momentos celulares, tais como quando ativados via estímulos distintos

Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a biomarker of kidney damage: a review / Lipocalina associada à gelatinase neutrofílica (NGAL) como um biomarcador de lesão renal: uma revisão

Neutrophil gelatinase- associated lipocalin (NGAL) is a protein molecule predominantly expressed in the distal nephron after the occurrence of renal injury. Unlike the serum creatinine and the glomerular filtration rate, which are the renal function markers, the increased levels of NGAL, both in serum and urine, are closely linked to the structural injury to the nephron. Clinical studies indicate that a few hours after the occurrence of acute renal injury, the serum and urinary levels of NGAL are already significantly elevated, while the serum creatinine levels and renal clearance only undergo significant changes between 24-48h after injury. Thus, the use of renal function markers, usually assessed in the clinical practice, they may have some limitations also hindering the implementation of early measures aimed at protecting the kidneys. This literature review aims at examining the biological aspects and the applications of NGAL measurement in some clinical conditions, including kidney failure, kidney diseases and renal ischemia.

Lipocalina associada à gelatinase neutrofílica (NGAL) é uma molécula proteica predominantemente expressa na parte distal do néfron após a ocorrência de lesão renal. Diferentemente da creatinina sérica e da taxa de filtração glomerular, que são marcadores de função renal, os níveis aumentados de NGAL, tanto no soro quanto na urina, estão intimamente ligados a lesões estruturais do néfron. Os estudos clínicos indicam que poucas horas após a ocorrência da lesão renal aguda os níveis séricos e urinários de NGAL já se apresentam significativamente elevados, enquanto os níveis séricos de creatinina e a sua depuração renal apenas sofrem alterações significativas entre 24-48h após a lesão. Assim, a utilização de marcadores de função renal, usualmente avaliados na prática clínica, pode apresentar algumas limitações além de dificultar a aplicação de medidas precoces que visam a proteção renal. Esta revisão da literatura tem por objetivo analisar os aspectos biológicos e as aplicações da mensuração de NGAL em algumas condições clínicas, incluindo injúria renal, nefropatias e isquemia renal.

Molecular detection of virulence factors among food and clinical Enterococcus faecalis strains in South Brazil

The present report aimed to perform a molecular epidemiological survey by investigating the presence of virulence factors in E. faecalis isolated from different human clinical (n = 57) and food samples (n = 55) in Porto Alegre, Brazil, collected from 2006 to 2009. In addition, the ability to form biofilm in vitro on polystyrene and the β-haemolytic and gelatinase activities were determined. Clinical strains presented a higher prevalence of aggregation substance (agg), enterococcal surface protein (esp) and cytolysin (cylA) genes when compared with food isolates. The esp gene was found only in clinical strains. On the other hand, the gelatinase (gelE) and adherence factor (ace) genes had similar prevalence among the strains, showing the widespread occurrence of these virulence factors among food and clinical E. faecalis strains in South Brazil. More than three virulence factor genes were detected in 77.2% and 18.2% of clinical and food strains, respectively. Gelatinase and β-haemolysin activities were not associated with the presence of gelE and cylA genes. The ability to produce biofilm was detected in 100% of clinical and 94.6% of food isolates, and clinical strains were more able to form biofilm than the food isolates (Student's t-test, p < 0.01). Results from the statistical analysis showed significant associations between strong biofilm formation and ace (p = 0.015) and gelE (p = 0.007) genes in clinical strains. In conclusion, our data indicate that E. faecalis strains isolated from clinical and food samples possess distinctive patterns of virulence factors, with a larger number of genes that encode virulence factors detected in clinical strains.

Prevalence and phenotypic characterization of Enterococcus spp. isolated from food in Brazil

We evaluated the frequency of enterococci from food and found 95.2% of positivity, being E. faecium and E. faecalis the most frequent species. High-level streptomycin resistance was observed, as well as gelatinase and hemolysis activity, showing the potential role of environmental strains as reservoir of virulence and resistance traits.

Heavy metal tolerance (Cr, Ag and Hg) in bacteria isolated from sewage

Samples of sewage from a university hospital and a chemistry technical school were analysed for the percentage of bacterial tolerance to chromium (Cr), silver (Ag) and mercury (Hg). Additionally, we investigated the effect of these metals on pigmentation and on some enzymatic activities of the metal tolerant strains isolated, as well as antimicrobial resistance in some metal tolerant Enterobacteriaceae strains. Tolerance to Cr was observed mainly in Gram positive bacteria while in the case of Ag and Hg the tolerant bacteria were predominately Gram negative. Hg was the metal for which the percentage of tolerance was significantly higher, especially in samples from the hospital sewage (4.1%). Mercury also had the most discernible effect on color of the colonies. Considering the effect of metals on the respiratory enzymes, one strain of Ag-tolerantBacillus sp. and one of Hg-tolerant P. aeruginosa were unable to produce oxidase in the presence of Ag and Hg, respectively, while the expression of gelatinase was largely inhibited in various Gram negative strains (66% by Cr). Drug resistance in Hg-tolerant Enterobacteriaceae strains isolated from the university hospital sewage was greater than 80%, with prevalence of multiple resistance, while the Ag-tolerant strains from the same source showed about 34% of resistance, with the predominance of mono-resistance. Our results showed that, despite the ability of metal tolerant strains to survive and grow in the presence of these elements, the interactions with these metals may result in metabolic or phisiological changes in this group of bacteria.

Transplante de células da medula óssea na insuficiência cardíaca chagásica: relato da primeira experiência humana / Bone marrow cell transplantation in chagas' disease heart failure: report of the first human experience / Transplante de células de la médula ósea en la insuficiencia cardíaca de la enfermedad de chagas: relato de la Primera Experiencia Humana

FUNDAMENTO: Insuficiência cardíaca (IC) causada por Doença de Chagas (DC) é uma cardiomiopatia inflamatória progressiva que afeta milhões de pessoas na América Latina. Estudos com modelos de camundongo de IC devido à DC indicam que o transplante de células mononucleares derivadas da medula óssea (TCDMO) pode reduzir a inflamação, fibrose e melhorar a função miocárdica. OBJETIVO: O propósito desse estudo foi avaliar, pela primeira vez em seres humanos, a segurança e a eficácia de TCDMO no miocárdio de pacientes com IC devido à DC. MÉTODOS: Um total de 28 pacientes com IC devido à DC (média de idade de 52,2 ± 9,9 anos) com classe funcional NYHA III e IV foram submetidos à TCDMO através de injeção coronariana. Os efeitos na fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE), capacidade funcional, qualidade de vida, arritmias e parâmetros bioquímicos, imunológicos e neuro-humorais foram avaliados. RESULTADOS: Não houve complicações diretamente relacionadas ao procedimento. A FEVE foi 20,1 ± 6,8 por cento e 28,3 ± 7,9 por cento, p < 0,03 a nível basal e 180 dias após o procedimento, respectivamente. No mesmo período, melhoras significantes foram observadas na classe funcional NYHA (3,1 ± 0,3 para 1,8 ± 0,5; p < 0,001), qualidade de vida (50,9 ± 11,7 para 25,1 ± 15,9; p < 0,001), e no teste de caminhada de seis minutos (355 ± 136 m para 437 ± 94 m; p < 0,01). Não houve alterações nos marcadores de ativação imune ou neurohormonais. Nenhuma complicação foi registrada. CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem que a injeção intracoronariana de células derivadas da medula óssea é segura e potencialmente efetiva em pacientes com IC devido à DC. A extensão do benefício, entretanto, parece ser discreta e precisa ser confirmada em estudos clínicos maiores, randomizados, duplo-cegos, controlados com placebo.

BACKGROUND: Heart failure due to Chagas' disease (HFCD) is a progressive inflammatory cardiomyopathy that affects millions of individuals in Latin America. Studies using mice models of HFCD indicate that bone marrow mononuclear cell transplantation (BMCT) may reduce inflammation, fibrosis, and improve myocardial function. OBJECTIVE: The purpose of this study was to evaluate, for the first time in humans, the safety and efficacy of BMCT to the myocardium of patients with HFCD. METHODS: A total of 28 HFCD patients (mean age 52.2 ± 9.9 years) with NYHA class III and IV were submitted to BMCT through intracoronary injection. Effects on the left ventricle ejection fraction (LVEF), functional capacity, quality-of-life, arrhythmias, biochemical, immunological, and neuro-humoral parameters, were evaluated. RESULTS: There were no complications directly related to the procedure. LVEF was 20.1 ± 6.8 percent and 28.3 ± 7.9 percent, p < 0.03 at baseline and 180 days after the procedure, respectively. In the same period, significant improvements were observed in the NYHA class (3.1 ± 0.3 to 1.8 ± 0.5; p < 0.001), quality-of-life (50.9 ± 11.7 to 25.1 ± 15.9; p < 0.001), and in the six-minute walking test (355 ± 136 m to 437 ± 94 m; p < 0,01). There were no changes in markers of immune or neurohormonal activation. No complications were registered. CONCLUSION: Our data suggest that the intracoronary injection of BMCT is safe and potentially effective in patients with HFCD. The extent of the benefit, however, appears to be small and needs to be confirmed in a larger randomized, double blind, placebo controlled clinical trial.

FUNDAMENTO: La insuficiencia cardíaca (IC), causada por la enfermedad de Chagas (EC), es una cardiomiopatía inflamatoria progresiva que afecta a millones de personas en Latinoamérica. Estudios con modelos experimentales de IC en razón de la EC, nos indican que el transplante de células mononucleares derivadas de la médula ósea (TCMO), puede reducir la inflamación y la fibrosis, mejorando así la función miocárdica. OBJETIVO:El objetivo de este estudio fue evaluar, por primera vez en seres humanos, la seguridad y la eficacia del TCMO en el miocardio de pacientes con IC debido a la EC. MÉTODOS:Fueron estudiados un total de 28 pacientes con IC debido a la EC (con edad promedio 52,2 ± 9,9 años), en clases funcionales III y IV (NYHA), al TCMO por medio de una inyección coronaria. Se evaluaron los efectos en la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI), capacidad funcional, calidad de vida, arritmias y parámetros bioquímicos, inmunológicos y neurohumorales. RESULTADOS:No se registraron complicaciones relacionadas directamente con el procedimiento. La FEVI pasó de 20,1 ± 6,8 por ciento para 28,3 ± 7,9 por ciento, p < 0,03, cuando se comparó con el período basal y 180 días después del procedimiento, respectivamente. En el mismo período, también se observaron mejorías en la clase funcional NYHA promedio (3,1 ± 0,3 para 1,8 ± 0,5; p < 0,001), puntuación de calidad de vida de Minnesota (50,9 ± 11,7 para 25,1 ± 15,9; p < 0,001), y en el test de esfuerzo de seis minutos (355 ± 136 m para 437 ± 94 m; p < 0,01). No hubo alteraciones en los marcadores de activación inflamatoria o neurohormonales. Ninguna complicación fue registrada. CONCLUSIÓN:Nuestros datos sugieren que la inyección intracoronaria de las células derivadas de la médula ósea es segura y potencialmente efectiva en pacientes con IC debido a la EC. La extensión del beneficio, sin embargo, parece ser discreta, y necesita ser confirmada en los ensayos clínicos randomizados, doble ciegos, controlados con placebo.

Efecto de la concentración de hidróxido de calcio y tiempo de cocción del grano de maíz (Zea mays L) nixtamalizado, sobre las características fisicoquímicas y reológicas del nixtamal / Effect of calcium hydroxide concentration and cooking time of corn grain (Zea mays L) nixtamalized, over physicochemical and rheological nixtamal characteristics

Se evaluó el efecto de la concentración de hidróxido de calcio (Ca(OH)2) y tiempo de cocción del grano de maíz sobre las propiedades fisicoquímicas y reológicas durante la nixtamalización tradicional. Se observó que a mayor concentración de Ca(OH)2 y mayor tiempo de cocción del grano, la temperatura de gelatinización aumentó significativamente. El maíz nixtamalizado con 2 g/100g de Ca(OH)2 y 60 min de tiempo de cocción, presentó mayor absorción de calcio, 0.152 g/100g, mostrando un aumento significativo respecto a la concentración inicial (500 g/100g). Todas las muestras presentaron un patrón de difracción de rayos X de almidón tipo A, con diferencias en la intensidad de la difracción. La viscosidad aparente del nixtamal disminuyó considerablemente al utilizar condiciones de procesamiento más altas. Se encontró que la capacidad de retención de agua aumentó con la temperatura.

The effect of calcium hydroxide (Ca(OH)2) concentration and cooking time on physicochemical and pasting properties of maize, during traditional nixtamalization was evaluated. It was observed that the higher the Ca(OH)2 concentration and cooking time the higher the gelatinization temperature. Grain samples treated with 2 g/100g of Ca(OH)2 and 60 min of cooking time presented higher calcium absorption (0.152 g/100g) showing a significant increment (500 g/100g). Results of X-ray diffraction showed that all the samples had X-ray diffraction pattern of starch type A, showing differences in the intensity of the diffraction as indicated by the percentage of cristallinity. The apparent viscosity of the nixtamal considerably decreased when the processes conditions were higher. Water retention capacity increased with temperature.

[Investigation of gelatinase- B enzyme role in invasion and metastasis of breast cancer]

Gelatinase B or collagenase type IV is a 92 kDa protein. In case of over-expression of the gene, because of its collagenase activity, it can be involved in metastasis activity of few cancers e.g. bladder, colorectal and gastric carcinoma. Single nucleotide substitution base polymorphism of C to T at -1562 of promotor region can increase gene expression by decreasing transcription inhibitor proteins binding at T alleles. The aim of this case-control study is to investigate the role of this polymorphism in development and invasion of breast cancer in Isfahan women population. At this study 90 breast cancer patients with metastasis and 100 healthy controls were analyzed using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism assay [PCR-RFLP]. The mean of follow up period was 2 years. Patients were checked every 3-5 months Data analysis showed a close association between the presence of T allele and invasion of breast cancer [OR = 5.85, 95% CI: 2.64-12.93, p <0.0001]. According to our findings, the major role of this polymorphism is in cancer cell metastasis and invasion of these cells to adjacent tissues

Experimental ophitoxemia produced by the opisthoglyphous lora snake (Philodryas olfersii) venom

Várias serpentes da família Colubridae produzem secrecões orais venenosas. Neste trabalho, foi estudado o veneno coletado da presa posterior da serpente opistóglifa venezuelana Philodryas olfersii. Deferentes proteínas estavam presentes no veneno, sendo caracterizadas pela eletroforese de proteínas (SDS-PAGE) a 20%. A secrecão mostrou atividade proteolítica (gelatinase) a qual foi parcialmente purificada em uma coluna de intercâmbio iônico (mono Q2). Adicionalmente, a atividade hemorrágica do veneno de Philodryas olfersii foi demonstrada em embriões de galinha, pele e peritônio de rato. Os sintomas neurológicos foram demonstrados em camundongos inoculados com veneno de Philodryas olfersii. Em conclusão, o veneno da Philodryas olfersii mostrou atividade proteolítica, hemorrágica, e neurotóxica, assim aumentando o interesse na elevada acão tóxica do veneno da Philodryas olfersii.

Reabsorçäo dentária fisiológica: estudo dos mecanismos (Apoptose) e das moléculas desencadeadoras (Bmp-4 e Gelatinase B) em dentes decíduos de gatos / Physiologic tooth resorption: mechanism study (apoptosis) and of molecules (Bmp 4 and Gelatinase B) in cats' deciduous teeth

A reabsorçäo dentária fisiológica ou rizólise em dentes decíduos, representa um fenômeno natural e programado pelo organismo, seguido pela substituiçäo da dentiçäo temporária pela permanente. Para estudar os mecanismos e mediadores bioquímicos envolvidos na induçäo da reabsorçäo fisiológica foram utilizados caninos e incisivos decíduos de gatos, em diferentes estádios de rizólise. Os animais utilizados tinham aproximadamente dois meses de vida pós-natal. O caráter programado da reabsorçäo dentária fisiológica motivou o estudo da participaçäo da apoptose neste processo. A apoptose foi evidenciada pela técnica TUNEL modificada nos cementoblastos, fibroblastos do tecido pulpar, do ligamento periodontal e nos restos epiteliais de Malassez dos dentes decíduos. A partir desta marcaçäo buscou-se identificar os prováveis mediadores bioquímicos indutores da apoptose nestas células, utilizando-se da hibridizaçäo in situ com radiosótopos. Uma das proteínas envolvidas na induçäo da apoptose em eventos fisiológicos, a proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4), foi detectada nos cementoblastos e células do ligamento periodontal do dente decíduo. Topograficamente observou-se uma similaridade entre a expressäo de Bmp-4 e a técnica TUNEL modificada em cortes idênticos. Uma intensa marcaçäo de Bmp-4 foi também observada nos ameloblastos do dente permanente. Para a análise da participaçäo dos clastos na rizólise, foi avaliada via hibridizaçäo in situ, a expressäo de gelatinase B, uma metaproteinase da matriz extracelular sintetizada por estas células...

Role of tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) in colorectal carcinoma

Increased production of matrix metalloproteinases (MMPs) has been associated with increases in invasive and metastatic potential in many types of human carcinoma. Tissue inhibitors of metalloproteinase (TIMP)-1 inhibits most interstitial collagenases and MMP-9. TIMP-2 binds specifically and noncovalently to the pro-form of MMP-2 and inhibits its enzyme activity. In this study, we examined TIMP-1 and TIMP-2 expressions in relation to clinicopathological variables in colorectal carcinoma with in situ hybridization and immunohistochemistry. TIMP-1 and TIMP-2 expressions were localized overwhelmingly to pericancer stromal cells, while malignant and normal mucosal cells were weak or negative. Strong stromal TIMP-1 immunoreactivity correlated with Dukes' stage (p=0.022), status of lymph node metastasis (p=0.044) and poor survival (p= 0.005). The degree of immunohistochemical staining of TIMP-2 did not correlate with all clinicopathological variables. The correlation between enhanced TIMP-1 expression and advanced stage and poor survival suggest a growth promoting activity of TIMP-1 in colorectal carcinoma.

Assay of matrix metalloproteinases in substrate impregnated gels in multiwells.

A zymographic method for the assay of matrix metalloproteinases in substrate impregnated gels in multiwells has been developed for the analysis of a large number of samples at a time. Enzyme was copolymerized with 300 microliters of 10% acrylamide impregnated with gelatin substrate and incubated for 16 hr. The gels were stained with coomassie blue, destained with water and the intensity measured in a densitometer. This method was tested with pure bacterial collagenase and three different gelatinases purified from rat mammary gland. The characteristics of these enzymes such as cation dependence, inhibition and concentration dependence have been examined by this method.