Efeitos do citrato de clomifeno, letrozol e estradiol sobre apoptose em células do cumulus oophorus humano / Effects of clomiphene citrate, letrozole and estradiol on apoptosis in human cumulus oophorus cells

RESUMO

Citrato de clomifeno (CC) e letrozol (LE) são indutores de ovulação que, apesar das altas taxas de ovulação confirmada, atingem baixas taxas de gravidez. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos de CC e LE in vitro, isoladamente ou em combinação com estradiol (E), na apoptose de células do cumulus oophorus humano. Realizamos um estudo prospectivo controlado utilizando culturas primárias de células do cumulus de pacientes submetidas à fertilização in vitro (n=22). A coloração com Giemsa e a imunocitoquímica para alfa-inibina foram utilizadas para avaliar a pureza e a morfologia da cultura celular. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio MTT, o ciclo celular por citometria de fluxo e a expressão gênica de Caspase-3, Bax e Superóxido dismutase 2 (SOD-2) e S26 por reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real. As células foram tratadas por 24 horas em 5 grupos de tratamento: CC, CC + E, LE, LE + E e controle. Nenhum dos tratamentos afetou a viabilidade celular, mas o LE reduziu a porcentagem média de células na fase S em relação ao controle (24,79 versus 21,70, p=0,0014). O tratamento com CC aumentou a expressão gênica de Bax (4 vezes) e SOD-2 (2 vezes), que foi revertida quando adicionado E à cultura. A expressão de SOD-2 aumentou em células tratadas com LE quando comparado ao controle (4 vezes), que foi também revertida por adição de E. Estes achados sugerem que CC e LE não afetam significativamente a viabilidade das células do cumulus humana. Porém, houve modulação na expressão de genes envolvidos na apoptose por essas drogas isoladamente e em associação com E, sugerindo que CC e LE podem ter efeitos diretos nas células do cumulus além de seus mecanismos de ação conhecidos.

ABSTRACT

Clomiphene citrate (CC) and letrozole (LE) are ovulatory stimulants that, despite high ovulation rates, achieve low pregnancy rates. This study aimed to investigate the in vitro effects of CC and LE, alone or in combination with estradiol (E), on apoptosis in human cumulus cells. We performed a controlled prospective study using primary cumulus cell cultures from patients undergoing in vitro fertilization (n=22). Giemsa stain and alpha-inhibin immunocytochemistry was used to assess cell culture purity and morphology. Cell viability was evaluated by MTT assay, cell cycle status by flow cytometry, and Caspase-3, Bax and superoxide dismutase 2 (SOD-2), and S26 gene expression by real-time polymerase chain reaction (qPCR). Cells were treated for 24 hours in 5 conditioned media: CC, CC + E, LE, LE + E and control. None of the treatments affected cell viability, but LE reduced the mean percentage of cells in the S phase compared to control (24.79 versus 21.70, p=0.0014). CC treatment increased mRNA expression of Bax (4 fold) and SOD-2 (2 fold), which was reversed by co-treatment with E. SOD-2 expression increased in cells treated with LE compared to control (4 fold), which was also reversed by E. These findings suggest that CC and LE do not significantly affect the viability of human cumulus cells. Still, the expression of genes involved in apoptosis was modulated by these drugs alone and in association with E, suggesting that CC and LE may have direct effects on cumulus cells beyond their known mechanisms of action.