Padronização do uso da monoazida de propídio (PMAxxTM) na detecção de viabilidade do Mycobacterium leprae / Standardization of the use of propidium monoazide (PMAxxTM) in the detection of Mycobacterium leprae viability

RESUMO

Introdução A hanseníase é uma doença infecciosa crônica, causada peloMycobacterium leprae, que se manifesta na pele e pode invadir o sistema nervoso periférico do paciente. O cultivo de seu agente etiológico em meios de cultura artificiaisou celulares ainda é um desafio e obstáculo para estudos relacionados à sua microbiologia. Para avaliar a viabilidade de células bacterianas, utiliza-se corantes fluorescente, como a monoazida de propídeo (PMA). O corante penetra somente nas células que estão com a membrana celular comprometida e reage com fração de hidrocarboneto a fim de resultar em uma modificação permanente do DNA. Objetivo Padronizar a utilização do corante monoazida de propídeo (PMAxx™) em combinação com a técnica de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT qPCR) para detecção da viabilidade do M. leprae. Metodologia Diferentes concentrações de PMAxx™ foram adicionadas a 250µl de suspensão bacilar purificada, proveniente de coxim plantar de camundongos previamente infectados. As amostras foram incubadas no escuro por diferentes tempos. Após a incubação, foram fotoativadas por exposição em lâmpada halógena de 650 W. Foram avaliados os parâmetros de concentração bacilar, tempo de incubação no escuro, tempo de exposição à luz e concentração do PMAxx™. O DNA do bacilo foi extraído utilizando-se um kit comercial e amplificadas por RT qPCR, com uso de primers específicos para as regiões Specific Repetitive Element (RLEP) do DNA de M. leprae Resultados Não houve diferença significativa no valor do ΔCt em nenhuma das concentrações de bacilos, indicando que não foi possível fazer a discriminação entre células vivas e inviáveis. O tempo ideal de incubação no escuro foi de 60 minutos, pois apresentaram uma diferenciação significativa do ΔCtvivo-morto com PMAxxTM e ΔCtmorto com e sem PMAxxTM. Em relação ao tempo de fotoativação, o maior valor de ΔCt observado foi submetido a sete minutos em exposição à luz. A concentração do PMAxxTM que apresentou uma diferenciação de ΔCt maior foi de 25µL. Discussão Os resultados mostram que o PMAxx™ tem uma boa eficácia com outras bactérias, mas ainda apresenta dificuldades em intercalar ao DNA de M. leprae. O uso do corante após análise com RT qPCR/RLEP para o bacilo é um método que ainda necessita de ajustes nos parâmetros como purificação da amostra, tempo de exposição e fotoativação. Esses dados ainda são preliminares e não inviabilizam a perspectiva de novos experimentos a partir dos ajustes nos parâmetros já avaliados.

ABSTRACT

Introduction Leprosy is a chronic infectious disease, caused by Mycobacterium leprae, which manifests itself in the skin and may invade the peripheral nervous system of the patient. Culturing its etiologic agent in artificial or cell culture media is still a challenge and obstacle for studies related to its microbiology. To assess the viability of bacterial cells, fluorescent dyes such as propidium monoazide (PMA) are used. The dye penetrates only cells with a compromised cell membrane and reacts with a hydrocarbon fraction to result in a permanent modification of the DNA Objective To standardize the use of the dye propidium monoazide (PMAxx™) in combination with the real-time polymerase chain reaction (RT qPCR) technique for detection of M. leprae viability Methodology Different concentrations of PMAxx™ were added to 250µl of purified bacillary suspension from plantar cushion of previously infected mice. The samples were incubated in the dark for different times. After incubation, they were photoactivated by exposure in a 650 W halogen lamp. The parameters of bacillary concentration, incubation time in the dark, light exposure time and concentration of PMAxx™ were evaluated. The bacillus DNA was extracted using a commercial kit and amplified by RT qPCR using specific primers for the Specific Repetitive Element (RLEP) regions of the M. leprae Results There was no significant difference in the ΔCt value at any of the bacilli concentrations, indicating that discrimination between live and non-viable cells was not possible. The optimal incubation time in the dark was 60 minutes, as they showed a significant differentiation of ΔClive-dead with PMAxxTM and ΔCtdead with and without PMAxxTM. Regarding photoactivation time, the highest value of ΔCt observed was subjected to seven minutes in light exposure. The concentration of PMAxxTM that showed a greater differentiation of ΔCt was 25µL Discussion The results show that PMAxx™ has good efficacy with other bacteria, but still presents difficulties in intercalating to M. leprae DNA. The use of the dye after analysis with RT qPCR/RLEP for the bacillus is a method that still needs adjustments in parameters such as sample purification, exposure time and photoactivation. These data are still preliminary and do not preclude the prospect of new experiments based on adjustments in the parameters already evaluated.