Polymerase chain reaction amplification of genomic fragments of bovine herpesvirus-1

Especial conditions were developed for the amplification of five DNA segments from US region of BHV-1 by polymerase chain reaction. In order to eliminate most nonspecific products it was found that addition of three cosolvents DMSO, glycerol and NP 40 was a simple method for increasing the specificity of amplification.

Serological responses in sheep injected with plasmids encoding bovine herpesvirus 1 (BHV-1) gD glycoprotein

A genetic vaccine consisting of the bovine herpesvirus-1.2a (BHV-1.2a) glycoprotein D (gD) gene under the control of the cytomegalovirus immediate-early promoter/enhancer was generated and administered to sheep intramuscularly in the neck. All animals developed serum antibodies which recognized the homologous antigen (BHV-1.2a strain BH-83) and also exhibited cross-reactivity against the heterologous antigen (BHV-5 strain EVI-190). Three intramuscularly injections were given but serological responses were not improved after the second inoculation. Specific antibodies were detected against BHV-1.2a until at least 12 months after the first inoculation. However, the capacity to induce antibodies against BHV-5 was lower and of shorter duration than to BHV-1.2a.

Detecçäo de amostras brasileiras do herpesvirus bovino 1 (BHV-1) pela reaçäo em cadeia pela polimerase / Detection of different Brazilian strains of the bovine herpesvirus-1 (BHV-1) by polymerase chain reaction

A técnica da reaçäo em cadeia pela DNA polimerase (PCR) foi usada para a amplificaçäo rápida de um fragmento de 456bp da regiäo única curta (Us) do genoma do BHV-1. Iniciadores de 18pb do gene da ORF1 foram usados para a amplificaçäo das amostras-padräo e brasileiras. Uma amplificaçäo clássica näo foi bem sucedida. A amplificaçäo foi obtida quando se escolheu uma regiäo com baixa concentraçäo de GC no DNA do BHV-1 e através da desnaturaçäo térmica (95§C para 5min) seguida de ciclos térmicos (94§C por 1min e 30seg; 52§C por 1min; 72§C por 1min e 30 seg; e ainda por 35 ciclos de 94§C por 1min; 52§C por 1min; 72§C por 1min e 30 seg; usando um tempo de extensäo final de 72§C por 5min). A clivagem com Pst I confirmou a especificidade do fragmento da ORF 1 do BHV-1. A amplificaçäo do fragmento em todas as amostras testadas sugere que a regiäo é fortemente conservada no genoma do BHV-1. Este PCR poderá detectar rapidamente amostras clínicas, sendo sensível e específico para diagnosticar infecçöes pelo BHV-1

Desenvolvimento de uma sonda de DNA para a detecçäo do vírus da doença de Aujeszky / Development of DNA probe for detection of Aujeszky's disease virus

Uma sonda radioativa e uma outra biotinilada foram produzidas para detecçäo do vírus da doença de Aujeszky (VDA). O fragmento de Bam H I 7 do DNA genômico do VDA foi marcado por "nick translation" empregando P32dCTP e um fragmento de 196pb, resultante de uma amplificaçäo pela reaçäo em cadeia pela polimerase marcado com biotina 7-dATP. Essas sondas, de uma maneira rápida e específica, prestaram-se para a detecçäo da infecçäo aguda pelo VDA. Entretanto, näo se mostraram sensíveis o suficiente para detectar seqüências genômicas de VDA no gânglio trigêmio de suínos e camundongos com infecçäo latente

Caracterizaçäo parcial de uma amostra brasileira do vírus da doença de Aujeszky isolada / Partial characterization of a Brazilian strain of Aujeszky's disease virus recovered from a pig with subclinical infection

Uma amostra brasileira do vírus da doença de Aujeszky, isolada de um leitäo, foi estudada quanto à virulência para suínos e seu genoma analisado no que se refere ao padräo de fragmentaçäo pela enzima de restriçäo Bam HI. Leitöes com 50 dias de idade, sorologicamente negativos, expostos a essa amostra, näo mostraram sinais de doença e o vírus foi detectado na regiäo orofaríngeana durante pelo menos três dias após exposiçäo. Com base no padräo de migraçäo dos fragmentos de restriçäo, o isolamento foi classificado como pertencente ao grupo I da classificaçäo proposta por Herrmann. Infecçäo latente foi detectada por PCR em todos os suínos. Algumas variaçöes foram identificadas no mapa físico de Bam HI da amostra ASB Piau quando se comparou com o mapa obtido da amostra virulenta brasileira LA03l

Detecçäo do vírus da hepatite murina utilizando-se a reaçäo em cadeia pela polimerase / Detection of mouse hepatitis virus in mouse colonies using the nested polymerase chain reaction

Desenvolveu-se a técnica de transcriçäo reversa - reaçäo em cadeia pela polimerase para detectar o vírus da hepatite do camundongo em tecido hepático. Para se eliminar possíveis falhas na reaçäo de amplificaçäo RT-PCR usou-se um segundo ciclo de amplificaçäo com primers internos para confirmar a especificidade e aumentar a sensibilidade do teste. Após a optimizaçäo do protocolo, descreve-se a detecçäo da amplificaçäo específica da seqüência-alvo em camundongos de 18 das 20 colônias examinadas

Main features of DNA-based immunization vectors

DNA-based immunization has initiated a new era of vaccine research. One of the main goals of gene vaccine development is the control of the levels of expression in vivo for efficient immunization. Modifying the vector to modulate expression or immunogenicity is of critical importance for the improvement of DNA vaccines. The most frequently used vectors for genetic immunization are plasmids. In this article, we review some of the main elements relevant to their design such as strong promoter/enhancer region, introns, genes encoding antigens of interest from the pathogen (how to choose and modify them), polyadenylation termination sequence, origin of replication for plasmid production in Escherichia coli, antibiotic resistance gene as selectable marker, convenient cloning sites, and the presence of immunostimulatory sequences (ISS) that can be added to the plasmid to enhance adjuvanticity and to activate the immune system. In this review, the specific modifications that can increase overall expression as well as the potential of DNA-based vaccination are also discussed