Avaliação do efeito central da crotalfina na neuropatia periférica induzida em camundongos / Evaluation of the central effect of crotalphine on induced peripheral neuropathy in mice

Pain is considered a public health problem. Estimates suggest that 20º/o of the adult worldwide population suffers from different types of pain. Particularly in relation to chronic pain, it may have inflammatory origin and I or to be due to nerve damage, altering the functionality of the sensory system (nociception) as well as the neuroimmune interface. Despite the advances of the research in this field, the treatment of pain still presents great difficulties, since even with the administration of the medicines clinically available, many patients report an incomplete reversal of the painful state and undesirable adverse effects. Crotalphine (CRO) is a synthetic peptide produced from the sequence of the natural analgesic factor isolated from the venom of the Crotalus durissus terrificus snake that induces potent and long-lasting antinociceptive effect in acute and chronic pain models. ln relation to its peripheral effect, it is known that it occurs by the release of endogenous opioids, particularly dynorphin A, and this release is dependent on the activation of cannabinoid type 2 receptors. ln the present work we demonstrate that the central analgesic effect of crotalphine involves participation of mu, kappa and delta opioid receptors as well as endogenous opioids release in addition to dynorphin A, such as met-enkephalin and beta-endorphin. ln addition, our data demonstrated the participation of CB1 and CB2 cannabinoid receptors in this effect, but there is no endocannabinoids involvement. We also verified that resident cells of the central nervous system, particularly microglia, play an important role in the central analgesic effect, and that crotalphine also reduces the release of interleukin 6 (IL-6), reinforcing its effect on the inflammatory response.

A dor é considerada um problema de saúde pública. Estimativas sugerem que 20°/o da população mundial adulta sofre de diferentes tipos de dor. Particularmente em relação à dor crônica, esta pode ter origem inflamatória e/ou decorrente de lesão nervosa, alterando o funcionamento do sistema sensorial (nocicepção) bem como a interface neuroimune. Apesar dos avanços das pesquisas, o seu tratamento ainda apresenta grandes dificuldades, pots mesmo com a administração dos medicamentos clinicamente disponíveis muitos pacientes relatam reversão incompleta do quadro doloroso e são constantes os relatos dos seus efeitos adversos indesejáveis. A crotalfina (CRO) é um peptídeo sintético produzido a partir • da sequência do fato¡ analgésico natural isolado do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus que induz potente e prolongado efeito antinociceptivo, em modelos de dor aguda e crônica. Em relação ao seu efeito periférico, sabe-se que ele ocorre pela liberação de opioides endógenos, particularmente dinorfina A, sendo essa liberação dependente de ativação de receptores canabinoides do tipo 2. No presente trabalho demonstramos que centralmente o efeito analgésico da crotalfina envolve a participação de receptores opioides mu, kappa e delta bem como opioides endógenos além da dinorfina A, como met-encefalina e beta-endorfina. Além disso, nossos dados demonstraram a participação de receptores canabinoides CB1 e CB2 neste efeito, mas não de endocanabinoides. Verificamos ainda que células residentes do sistema nervoso central, particularmente micróglias, desempenham um papel importante no efeito analgésico central e que a crotalfina, ainda, reduz a liberação de interleucina 6 (IL-6) reforçando seu efeito sobre a resposta inflamatória.

Clinical, behavioral and antinociceptive effects of crotalphine in horses / Efeitos clínico, comportamental e antinociceptivo da crotalfina em equinos

ABSTRACT: Crotalphine is a novel analgesic peptide that acts on kappa opioid and delta receptors, causing powerful analgesia in rats submitted to inflammatory, neuropathic or oncologic models of pain. This study evaluated clinical, behavioral and antinociceptive effects caused by crotalphine in horses, employing 18 Arabian horses and it was divided in three phases. In Phase I, "clinical and behavioral effects", crotalphine did not change the latency to urinate and defecate; did not modify the values of cardiac or respiratory rates, intestinal motility and rectal temperature; and did not cause significant ataxia, head, eye and lip ptosis. In Phase II, "antinociceptive effect on intact skin at scapular or ischial region", crotalphine did not cause significant analgesia. In Phase III, "antinociceptive effect on incised skin at scapular or ischial region", crotalphine promoted effective antinociceptive effects for six hours and inhibited hyperalgesia state for three days in the ischial region of horses submitted to incisional model of inflammatory pain, but crotalphine did not evoke relevant analgesic effect on the scapular region. Concluding, intravenous injection of a single dose of crotalphine (3.8ngkg-1) did not cause important clinical or behavioral changes and promotes antinociceptive effect on incised ischial region for seven days in horses. Moreover, crotalphine did not evoke relevant anti nociceptive effect on the scapular region or in intact skin of horses.

RESUMO: A crotalfina é um novo peptídeo analgésico que atua em receptores opioides kappa e delta, causando analgesia potente em ratos submetidos a modelos de dorinflamatória, neuropática e oncológica. Este estudo avaliou os efeitos clínicos, comportamental e antinociceptivo da crotalfina em equinos, empregou 18 cavalos da raça Puro Sangue Árabe e foi dividido em três fases. Na Fase I, "efeitos clínicos e comportamentais", a crotalfina não alterou a latência para urinar e defecar; não interferiu nos valores de frequência cardíaca ou respiratória, motilidade intestinal etemperatura retal; e não causou ataxia, ptose labial, palpebral ou de cabeça significativas. Na Fase II, "efeito antinociceptivo na pele íntegra da região escapular ou isquiática", a crotalfina não gerou analgesia significativa. Na Fase III, "efeito antinociceptivo na pele incisada da região escapular ou isquiática", a crotalfina promoveu efeito antinociceptivo efetivo por seis horas e inibição da hiperalgesia por três dias na região isquiática de equinos submetidos ao modelo incisional de dor inflamatória, mas não houve analgesia relevante na região escapular. Conclui-se que uma única injeção de crotalfina (3,8ngkg-1) não causa alterações clínicas ou comportamentais importantes e promove efeito antinociceptivo na região isquiática incisionada durante sete dias em equinos. Além disso, a crotalfina não evoca efeito antinociceptivo relevante na região escapular e nem na pele intacta de cavalos.

Peripheral interactions between cannabinoid and opioid systems contribute to the antinociceptive effect of crotalphine.

BACKGROUND AND PURPOSE: Crotalphine is an antinociceptive peptide that, despite its opioid-like activity, does not induce some of the characteristic side effects of opioids, and its amino acid sequence has no homology to any known opioid peptide. Here, we evaluated the involvement of the peripheral cannabinoid system in the crotalphine effect and its interaction with the opioid system. EXPERIMENTAL APPROACH: Hyperalgesia was evaluated using the rat paw pressure test. Involvement of the cannabinoid system was determined using a selective cannabinoid receptor antagonist. Cannabinoid and opioid receptor activation were evaluated in paw slices by immunofluorescence assays using conformation state-sensitive antibodies. The release of endogenous opioid peptides from skin tissue was measured using a commercial enzyme immunoassay (EIA). KEY RESULTS: Both p.o. (0.008-1.0 µg·kg(-1) ) and intraplantar (0.0006 µg per paw) administration of crotalphine induced antinociception in PGE2 -induced hyperalgesia. Antinociception by p.o. crotalphine (1 µg·kg(-1) ) was blocked by AM630 (50 µg per paw), a CB2 receptor antagonist, and by antiserum anti-dynorphin A (1 µg per paw). Immunoassay studies confirmed that crotalphine increased the activation of both κ-opioid (51.7%) and CB2 (28.5%) receptors in paw tissue. The local release of dynorphin A from paw skin was confirmed by in vitro EIA and blocked by AM630. CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS: Crotalphine-induced antinociception involves peripheral CB2 cannabinoid receptors and local release of dynorphin A, which is dependent on CB2 receptor activation. These results enhance our understanding of the mechanisms involved in the peripheral effect of crotalphine, as well as the interaction between the opioid and cannabinoid systems.

Ausência de efeito antinociceptivo decorrente da administração intravenosa de crotalfina em comparação com morfina, U50-488H ou fenilbutazona em equinos submetidos à estimulação térmica da pele íntegra / Lake of antinociceptive effect caused by intravenous administration of crotalphine em comparision to morphine, U50-488H or phenylbutazone in horses submitted to thermal stimulation of the normal skin

Crotalfina é um novo peptídeo analgésico que atua em receptores opioides kappa e delta promovendo potente analgesia em ratos submetidos a modelos de dor inflamatória, neuropática ou oncológica. Talvez a crotalfina possa ser utilizada para tratar a dor em outras espécies. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a resposta nociceptiva na região escapular e isquiática de cavalos tratados com crotalfina, morfina, U50-488H ou fenilbutazona e submetidos à estimulação térmica na pele íntegra. Dezoito cavalos da raça Puro Sangue Árabe foram alocados em cinco grupos experimentais: GC (5mL NaCl 0,9%), GCRO (3,8mg.kg-1 crotalfina), GK (160 µg.kg-1 U50-488H), GM (0,1mg.kg-1 morfina) e GF (4,4mg.kg-1 fenilbutazona). Os animais foram submetidos ao modelo de dor inflamatória por meio de estimulação térmica (140°C) e durante 24h avaliou-se a latência para o reflexo do frêmito cutâneo na região escapular (LRFCesc) e isquiática (LRFCisq). O U50-488H apresentou efeito antinociceptivo na região isquiática por duas horas, porém, nos demais momentos do grupo GK, bem como nos grupos GC, GCRO, GM e GF, não foi observado efeito antinociceptivo, visto que a LRFCesc e a LRFCisq na pele íntegra de cavalos não aumentaram em 24 horas de avaliação. Portanto, a crotalfina, a morfina, o U50-488H e a fenilbutazona não produziram efeito antinociceptivo relevante em equinos submetidos à estimulação térmica em pele íntegra.

Crotalphine is a novel analgesic peptide that acts on kappa and delta opioid receptors providing powerful analgesia in rats submitted to inflammatory, neuropathic or oncologic pain model. Maybe crotalphine can be used to treat pain in other species. So, the aim of this study was to evaluate nociceptive response at scapular and isquiatic region of horses treated with crotalphine, morphine, U50-488H or phenylbutazone and submitted to thermal stimulation in complete skin. Eighteen Arabian horses were allocated in five experimental groups: GC (5mL NaCl 0.9%), GCRO (3.8ng.kg-1 crotalphine), GK (160 µg.kg-1 U50-488H), GM (0.1mg.kg-1 morphine) and GP (4.4mg.kg-1 phenylbutazone). Animals were submitted to inflammatory pain model by thermal stimulation (140°C) and during 24h latency to skin twitch at scapular and isquiatic region were evaluated. The U50-488H produced antinociceptive effect at isquiatic region along two hours, but, in other moments of GK and in the other groups there was not antinociceptive effect, because LRFCesc and LRFCisq in complete skin of horses did not increase during 24h evaluation. Thus, crotalphine, morphine, U50-488H and phenylbutazone did not cause relevant antinociceptive effect in horses submitted to thermal stimulation in complete skin.

Avaliação da expressão e ativação de receptores opióides após injúria periférica em ratos / Evaluation of expression and activation of opioid receptors after peripheral injury in rats

Este trabalho teve como objetivo avaliar os mecanismos envolvidos no aumento da eficácia analgesia da crotalfina (CRF), um peptídeo com atividade tipo opióide, na vigência de inflamação (prostaglandina E2/PGE2) ou lesão tecidual (constrição crônica do nervo isquiático/CCI). A PGE2 (intraplantar), em ratos, aumentou a expressão gênica e protéica de receptores opióides do tipo m e k, no gânglio da raiz dorsal (DRG) e nervo da pata (NP), quando comparado a animais naive. A CCI aumentou a expressão de receptores m e d, no DRG e diminuiu os níveis de receptores k. Embora a PGE2 e CCI, per se, não ativem receptores opióides o CRF e agonistas opióides acarretam maior ativação destes receptores na vigência de sensibilização por PGE2 e CCI. Ainda, o CRF ativa a via das MAPKs (ERK1/2 e JNK), apenas na presença de PGE2, efeito mediado por receptores do tipo k e PKCz. Estes dados mostram que a expressão e ativação de receptores opióides são diferentemente regulados pela injúria aguda ou crônica.

This study aimed to evaluate the mechanisms involved in the increased analgesic efficacy of crotalphine (CRP), an opioid-like peptide, under inflammation prostaglandin E2 (PGE2) and tissue injury (chronic constriction injury/CCI). PGE2 (intraplantar) in rats, increases the genic and proteic expression of m- and k-opioid receptors in the dorsal root ganglia (DRG) and nerve paw (NP), when compared to naïve rats. CCI up-regulates the expression of m and d -opioid receptors in DRG and NP. In contrast, k-opioid receptors were down-regulated by CCI. Although PGE2 and CCI, per se, do not activate opioid receptors, CRP and opioid agonists lead to a higher activation of these receptors in NP slices under PGE2 or CCI sensitization or in DRG cells incubated with PGE2. Moreover, CRP activates ERK1/2 and JNK MAPKs pathways, k-receptor and PKCz-mediated, only when the cells were pre-incubated with PGE2. These data indicate that the expression and activation of opioid receptors are distinctly regulated by the presence of acute or chronic injury.