Characterization of atypical Enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) isolated from dogs.

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), an important human pathogen has the ability to form attaching and effacing lesions on the intestinal epithelium and has been isolated from a wide range of species. Two EPEC subgroups are recognized: typical (tEPEC) and atypical (aEPEC) strains, differing by the presence of EAF plasmid and bundle-forming pilus (BFP) in typical strains and their absence in atypical strains. This study searched the presence of EPEC strains in 101 fecal samples of diarrheic (n=65) and non-diarrheic (n=36) dogs from two cities in Rio de Janeiro State, Brazil. The isolates were evaluated for the presence of eae, tir, espA, espB and bfpA genes, EAF plasmid, and for the insertion site of the LEE locus. Cell-adherence assays, fluorescent actin staining (FAS) test, hemolysin production and serotyping were also performed. Twenty eight aEPEC isolates were recovered from 48 eae-positive fecal samples, 24 from diarrheic animals and 4 from non-diarrheic ones. PCR showed that most isolates was positive for ß or γ intimin, and for ß or α subtypes of tir, espA and espB. Six isolates showed a selC insertion of locus LEE. Only two isolates from the same diarrheic animal harbored the bfpA gene, and none presented the EAF plasmid. Most isolates was FAS-positive and showed a localized adherence-like (LAL) in a 6h HeLa cell-adherence assay. A wide diversity of serotypes was detected including O4:H16 and O51:H40, previously described in human disease. The phenotypic and genotypic markers of aEPEC isolated from diarrheic and non-diarrheic dogs were similar to those found in isolates recovered from human disease.

Molecular investigation of tRNA genes integrity and its relation to pathogenicity islands in Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains

tRNA genes are known target sites for the integration of pathogenicity islands (PAI) and other genetic elements, such as bacteriophages, into bacterial genome. In most STEC (Shiga toxin-producing Escherichia coli), the PAI called LEE (locus of enterocyte effacement) is related to bacterial virulence and is mostly associated to the tRNA genes selC and pheU. In this work, we first investigated the relationship of LEE with tRNA genes selC and pheU in 43 STEC strains. We found that 28 strains (65 percent) had a disrupted selC and/or pheU. Three of these strains (637/1, 650/5 and 654/3) were chosen to be submitted to a RAPD-PCR technique modified by the introduction of specific primers (corresponding to the 5'end of genes selC and pheU) into the reaction, which we called "anchored RAPD-PCR". The PCR fragments obtained were transferred onto membranes, and those fragments which hybridized to selC and pheU probes were isolated. One of these fragments from strain 637/1 was partially sequenced. An 85-nucleotide sequence was found to be similar to the cfxA2 gene that encodes a beta-lactamase and is part of transposon Tn4555, a pathogenicity island originally integrated into the Bacteroides genome.

Genetic analysis of Escherichia coli strains carrying enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) markers, isolated from children in Rio de Janeiro city, Brazil

No presente estudo, 47 amostras enteropatogênicas de Escherichia coli, previamente caracterizadas pelo sorotipo, fenótipo de aderência, habilidade de induzir a formação da lesão histopatológica e presença das seqüências genéticas eae, bfp e EAF, foram analisadas de acordo com o perfil de fragmentação do DNA cromossômico pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE), as variantes isoenzimáticas através da eletroforese de isoenzimas (MLEE) e a presença de seqüências específicas da região LEE (eae, espA, espB, tir) e respectivos alelos. A amplificação destas seqüências mostrou a presença de 18 padrões genéticos distintos. A tipagem do gene eae revelou que a maior parte das amostras apresentou intimina não-tipável (42%) seguida dos tipos alélicos b (35%), g e a (12% cada). A fragmentação do DNA cromossômico detectou um elevado polimorfismo genético entre as amostras estudadas e não foi observada uma correlação com os marcadores de virulência investigados. Por outro lado, a análise das variantes isoenzimáticas sugeriu uma distribuição clonal específica de variantes genéticas do locus eae, o que nos leva a indicar a sua utilização como um marcador promissor para definir as relações genéticas neste grupo de microrganismos.

Genetic analysis of Escherichia coli strains carrying enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) markers, isolated from children in Rio de Janeiro city, Brazil

In the present study, 47 enteropathogenic Escherichia coli strains identified according to serotyping, presence of eae, bfp and EAF sequences, adherence phenotype and ability to induce attaching-effacing lesions were analyzed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), multilocus enzyme electrophoresis (MLEE), and the presence of LEE genes (eae, espA, espB, tir) as well as the respective alleles. Amplification of LEE genes subtypes revealed 18 different pathotypes. Typing of the eae gene showed that most strains contained nontypable intimin (42%) followed by beta (35%), gamma and alpha genes (12% each). PFGE analysis revealed a variable degree of polymorphism among isolates and, in general, no clear correlation was observed among PFGE profiles and the virulence markers identified. Otherwise, grouping based on MLEE analysis showed a close association between eae allele and clonal cluster distribution leading us to indicate the eae profile as a promising marker to establish relatedness among such microorganisms.

No presente estudo, 47 amostras enteropatogênicas de Escherichia coli, previamente caracterizadas pelo sorotipo, fenótipo de aderência, habilidade de induzir a formação da lesão histopatológica e presença das seqüências genéticas eae, bfp e EAF, foram analisadas de acordo com o perfil de fragmentação do DNA cromossômico pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE), as variantes isoenzimáticas através da eletroforese de isoenzimas (MLEE) e a presença de seqüências específicas da região LEE (eae, espA, espB, tir) e respectivos alelos. A amplificação destas seqüências mostrou a presença de 18 padrões genéticos distintos. A tipagem do gene eae revelou que a maior parte das amostras apresentou intimina não-tipável (42%) seguida dos tipos alélicos beta (35%), gama e alfa (12% cada). A fragmentação do DNA cromossômico detectou um elevado polimorfismo genético entre as amostras estudadas e não foi observada uma correlação com os marcadores de virulência investigados. Por outro lado, a análise das variantes isoenzimáticas sugeriu uma distribuição clonal específica de variantes genéticas do locus eae, o que nos leva a indicar a sua utilização como um marcador promissor para definir as relações genéticas neste grupo de microrganismos.

Serotypes and antimicrobial susceptibility of Streptococcus pneumoniae isolated in Rio de Janeiro, Brazil

Foram estudadas 108 amostras de Streptococcus pneumoniae isoladas de pacientes com meningite. A sorotipagem foi realizada através de testes de entumescimento capsular, sendo identificados 29 diferentes sorotipos. Os sorotipos 6B (13,8%), 1 (12,0%) e 3 (10,0%) foram os mais frequentes, seguidos por 4, 14, 18C, 10A e 23F. Esses 8 sorotipos de maior prevalência constituiram 64,5% do total de amostras. Oitenta e nove (82,2%) amostras pertenciam a sorotipos incluidos na vacina pneumocócica composta por 23 antígenos polissacarídicos tipo-específicos. A susceptibilidade de 59 amostras e 16 agentes antimicrobianos foi testada através da técnica de microdiluiçäo em caldo. Das amostras testadas, 57 (97%) e 26 (44%) foram resistentes a, respectivamente, gentamicina e tetraciclina. Somente uma foi resistente ao sulfametoxazol-trimetoprim e todas se apresentaram sensíveis a penicilina e ao cloranfenicol. Embora näo tenham sido detectadas amostras consideradas resistentes a penicilina, 4 e 3 das amostras somente foram inibidas por concentraçöes respectivas de 0,03 e 0,06 microng de penicilina/ml. O cefotaxime se apresentou como a mais ativa das quatro cefalosporinas testadas

Atividades citotóxica e hemolítica em Escherichia coli uropatogênicas / Citotoxic and hemolytic activities of uropathogenic Escherichia coli

Estudamos 59 Escherichia coli uropatogênicas (ECUP) obtidas de pacientes com infecçäo urinária e 30 E. coli originárias das fezes de indivíduos normais. Cada amostra originou-se de um paciente ou controle. Verificamos que 44% e 3,3% respectivamente eram hemolíticas em meio sólido segundo a origem. Apenas 15% das ECUP hemolíticas produziram alfa-hemolisina, isoladamente ou em associaçäo com ß-hemolisina. A alfa-hemolisina correspondeu a 92% das amostras com atividade hemolítica. Näo encontramos correlaçäo entre títulos de alfa-hemolisina e o sítio de origem das ECUP (infecçäo alta ou baixa). Em 71% das ECUP e 30% das E. coli fecais detectamos a produçäo de citotoxina com açäo citocida para linhagens celulares epitelióides como Vero, He-La e Hep-2 e pouco ativa para fibroblastos de embriäo de galinha. A produçäo desta citotoxina näo apresenta correlaçäo com a síntese de hemolisinas. Näo verificamos associaçäo entre títulos citotóxicos e origem das ECUP. Certas características biológicas desta citotoxina como a resposta morfológica que determina nas células, o aumento dos títulos citotóxicos com o tempo, sua atividade citocida irreversível e sua termolabilidade sugerem analogia com a Verotoxina (VT) de E. coli. As células afetadas pela citoxina inicialmente mostram aspecto estrelado, tornam-se arredondadas e finalmente desprendem-se do seu suporte. É sugerido que a produçäo de citotoxina por E. coli aderidas às mucosas do trato urinário possa contribuir para a agressäo ao uroepitélio

Endocytosis-inducer adhesins produced by enteropathogenic serogroups of Escherichia coli participate on bacterial attachment to infant enterocytes

A infecçäo de células Hep-2 por E. coli enteropatogênicas (ECEP) implica na aderência bacteriana e posterior interiorizaçäo dos microrganismos aderidos por um mecanismo de endocitose. A aderência das ECEP é pré-requisito para a infecçäo e é mediada por adesinas que reconhecem receptores inibidos por certas oses na membrana celular. Tais "adesinas indutoras da endocitose" (AIE) também promovem a ligaçäo bacteriana a enterócitos obtidos do intestino delgado de lactente, sugerindo que as AIE possam desempenhar algum papel nas diarréias causadas por ECEP

Nasal secretions of Neisseria lactamica carriers have an inhibitory effect on Neisseria meningitidis attachment to human oroepithelial cells

As secreçöes nasais de voluntários colonizados por N. lactamica inibem a aderência de N. Lactamica e de meningococos dos grupos A e B à células oroepiteliais humanas, "in vitro". A aderência, nas amostras de Neisseria testadas, decorre da presença de adesinas näo-fimbriais que parecem possuir antígenos comuns. A despeito do surgimento de marcante atividade antiadesiva nas secreçöes nasais os voluntários persistiram como portadores de N. lactamica. A erradicaçäo do estado de portador parece assim ser dependente da açäo de diferentes fatores

Investigation on an adhesive property (localized adherence) characteristic of classic enteropathogenic serogroups of Escherichia coli

Estudamos E. coli enteropatogênicas clássicas (EPEC) isoladas de surtos epidêmicos e casos esporádicos de diarréia e amostras de E. coli e de outras enterobactérias associadas a infecçöes intestinais e extraintestinais. Empregando células Hep-2 verificamos que a "aderência localizada " (AL) ocorreu apenas em EPEC. E. coli näo-EPEC produtoras de pili tipo 1, CFA/I, CFA/II, K88, K99 ou 987P, enterobactérias apresentando diferentes mecanismos de virulência e EPEC provenientes de coleçäo foram negativosa para AL. O cultivo seriado em meio sólido inibe a AL enquanto o cultivo em meio líquido näo-aerado em fase exponencial, mas näo em fase estacionária, a estimula. EPEC produtoras de pili tipo 1 e de adesina de AL provinham principalmente de surtos epidêmicos e apresentavam elevados índices de AL, sugerindo cooperaçäo entre ambas as adesinas. Testes de inibiçäo da AL por carbohidratos, concanavalina A, LPS semipurificado e cations divalentes (Ca++., Mg++) e o tratamento prévio de bactérias e células por tripsina, glutaraldeído, calor e radiaçäo U.V., sugerem que a AL é mediada por glicoproteínas da superfície celular e por proteínas bacterianas. Variaçöes nos perfis de inibiçäo por carbohidratos, sugerem variaçäo estrutural nos receptores celulares e nas adesinas bacterianas, mesmo entre EPEC de idênticos sorogrupos. A AL é dependente da viabilidade bacteriana e celular e do prévio cultivo dos microrganismos em meio contendo Ca++ sugerindo internalizaçäo das bactérias aderidas às células

Attachment and intracellular penetration of classic enteropathogenic Escherichia coli into HEP-2 cells

Com E. coli dos sorogrupos 0111:K58 e 055:K59 observa-se, através de microscopia eletrônica, penetraçäo e provável multiplicaçäo intracelular em células Hep-2. Foram detectadas alteraçöes significativas da membrana citoplasmática das células, sugerindo um processo ativo de endocitose