Actividad citotóxica y antiproliferativa de un extracto rico en fucoidan de Lessonia trabeculata sobre células de adenocarcinoma mamario murino 4T1

Introducción. Los tumores neoplásicos se caracterizan por su invasividad y metástasis. Las células neoplásicas tienen heterogeneidad genética, por lo cual pueden desarrollar resistencia a los quimioterápicos. Por esta razón, las plantas continúan siendo una fuente importante de nuevos productos anticancerígenos. Objetivo. Evaluar la actividad citotóxica y antiproliferativa de un extracto rico en fucoidan de Lessonia trabeculata nativa (EFLt) sobre la línea celular de adenocarcinoma mamario murino, triple negativo 4T1. Métodos. La citotoxicidad y la IC50 se determinaron en monocapas de 4T1 empleando el reactivo MTT. Para demostrar la actividad antiproliferativa se aplicaron los métodos de cierre de herida y anticlonogénico utilizando las IC50 del EFLt y Dox (doxorubicina). El cierre de herida fue evaluado mediante barrido de tiempos discretos; el efecto anticlonogénico fue evaluado 7 días postratamiento mediante el conteo de colonias y se determinó la fracción de sobrevivencia. Adicionalmente, se evaluaron la citotoxicidad y actividad antiproliferativa combinando las IC50 de EFLt y Dox. El porcentaje de migración y conteo de colonias se realizó con el programa ImageJ. Resultados. La IC50 del EFLt (950 μg/mL) produjo 56% de citotoxicidad, 80,3% de inhibición de la migración celular, 68% de inhibición en la formación de colonias. La IC50 de Dox fue 0,5 μg/mL. Conclusiones. El EFLt ejerce citotoxicidad dependiente de la concentración y tiene efecto antiproliferativo sobre 4T1. Se requiere continuar los ensayos en modelos de mayor complejidad que permitan esclarecer el potencial antitumoral del EFLt.

Introduction. Neoplastic tumors are characterized by invasiveness and metastasis. Neoplastic cells are genetically heterogeneous and can develop resistance to chemotherapeutic agents. For this reason, plants continue to be an important source of new anticancer products. Objective. To determine the cytotoxic and antiproliferative activity of a fucoidan-rich extract of native Lessonia trabeculata (EFLt) on the tripe negative murine mammary adenocarcinoma cell line 4T1. Methods. Cytotoxicity and IC50 were determined in 4T1 monolayers using the MTT reagent. To demonstrate antiproliferative activity, "wound" closure and anticlonogenic methods were applied using the IC50 of EFLt and Doc (doxorubicin). "Wound" closure was evaluated by discrete times sweep to determine percentage inhibition of cell migration; the anticlonogenic effect was evaluated by colony counting 7 days after treatment and the survival fraction was determined. In addition, cytotoxicity and antiproliferative activity were evaluated by combining the IC50 of EFLt and Dox. Percent migration and colony counts were performed using ImageJ software. Results. The IC50 (950 μg/mL) of EFLt was 56% cytotoxicity, 80,3% inhibition of cell migration, 68% inhibition of colony formation.The ICof Dox was 0,5 μg/mL. Conclusions. EFLt exerts concentration-dependent cytotoxicity and antiproliferative effect on 4T1. Further studies in more complex models are needed to elucidate the anti-tumor potential of EFLt.

Aislamiento y caracterización de un péptido antibacteriano del veneno de Centruroides margaritatus / Isolation and characterization of antibacterial peptide from Centruroides margaritatus venom

En este trabajo se ha aislado y caracterizado parcialmente un péptido con actividad antibacteriana del veneno del escorpión Centruroides margaritatus (Gervais, 1841) (Scorpiones: Buthidae). Este péptido fue aislado a partirde 50 mg de veneno crudo, y la purificación fue inicialmente realizada por cromatografía de intercambio iónico en CM-Sephadex C-25, obteniéndose siete picos de proteína. El pico III de esta separación fue purificado porcromatografía de filtración en Sephadex G-75, obteniéndose dos picos de proteína, de los cuales el segundo mostró ser el péptido antibacteriano. Este péptido representa aproximadamente el 3% de la proteína total del veneno y por PAGE-SDS, se determinó que tiene un peso molecular de 7,3 kDa. El péptido antibacteriano inhibe el crecimiento de Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcencens, en microplacas con medio mínimo de Davies, pero los ensayos en agar Müller-Hinton, no mostraron halos de inhibición significativos, concluyéndo se que el péptido tiene actividad bacteriostática pero no bactericida. Además, no mostró acción sobre Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis y Klebsiella pneumoniae. El péptido antibacteriano también fue capaz de inhibir el crecimiento de Aspergillus níger y Candida albicans durante 48 horas, pero no tiene actividad hemolítica sobre eritrocitos humanos.

In this work, from the venom of Centruroides margaritatus (Gervais, 1841) (Scorpiones, Buthidae), one peptide with antibacterial activity was isolated and characterized. This peptide was isolated from 50 mg of wholevenom, the purification was initially performed by chromatography on CM-Sephadex C-25 obtaining protein peaks seven. The peak III of this separation was purified by gel filtration on Sephadex G-75, yielding protein peaks two, the second of which proved to be the antibacterial peptide. This peptide represents about 3 % of whole venom protein and by PAGE-SDS, was determinate it has 7,3 kDa of molecular weight. The antibacterial peptide inhibits the growth of Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcencens, in microplates with minimal media Davies, but in assays in Muller-Hinton agar, showed no significant inhibition halos; concluding that peptide has bacteriostatic activity but not bactericidal activity. In addition has not activity on Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis and Klebsiella pneumoniae. Antibacterial peptide also inhibited the growth of Aspergillus níger and Candida albicans during 48 hours, but has not hemolytic activity.

Péptidos antibacterianos de los venenos de Hadruroides mauryi y Centruroides margaritatus / Antibacterial peptides from Hadruroides mauryi and Centruroides margaritatus

En este trabajo se describen algunos péptidos antibacterianos de los venenos de los escorpiones Hadruroides mauryi (Francke y Soleglad, 1980) y Centruroides margaritatus (Gervais, 1841), aislados mediante cromatografía de intercambio iónico en CM Sephadex C-25 con buffer acetato de amonio 0,05M a pH 7. El veneno de H. mauryi (44,4 mg) fue separado en 7 fracciones proteicas. La fracción IV inhibió el crecimiento de Escherichia coli, Pseudomona aeuginosa y Bacillus cereus; la fracción V afectó a P. aeruginosa y B. cereus; y fracción VI mostró actividad sobre B. cereus. El veneno de C. margaritatus (50,6 mg) también fue fraccionado en 7 fracciones proteicas. La fracción II inhibió el crecimiento de Staphylococcus aureus; Las fracciones III, IV, V y VI afectaron a S. aureus, P. aeruginosa y B. cereus; y finalmente la fracción VII afectó a P. aeruginosa. En todos los casos los péptidos aislados fueron de naturaleza básica, con excepción del correspondiente a la fracción II de C. margaritatus. Adicionalmente determinamos que todos los péptidos carecen de acción hemolítica.

In this work, we describe antibacterial peptides from Hadruroides mauuryi and Centruroides margaritatus scorpion venom, isolated by ionic exchange chromatography with 0,05M ammonium acetate buffer pH 7. H. mauryi venom (44,4 mg) was separated in 7 protein peaks. IV peak inhibited growth of Escherichia coli, Pseudomona aeuginosa and Bacillus cereus: V peak affect to P. aeruginosa and B. cereus, and VI peak have activity on B. cereus. C. margaritatus venom (50,6 mg) was also separated en 7 protein peaks. II peak inhibited growth of Staphylococcus aureus; III, IV, V and VI peaks affect to S. aureus , P. aeruginosa and B. cerus; and finally VII peak affect to P. aeruginosa. All isolated peptides were of basic pH, with exception of II peak from C. margaritatus. In addition, all peptides have not hemolitic activity.

Purificación y caracterización parcial de una toxina (Hm3) del veneno de Hadruroides mauryi (Francke y Soleglad, 1980) (Scorpiones, luridae) / Purification and partial characterization of a toxin (Hm3) from Hadruroides mauryi (Francke y Soleglad, 1980) (Scorpiones, luridae) venom

Se ha purificado una toxina (Hm3) del veneno del escorpión Hadruroides mauryi, por cromatografía de intercambio iónico en CM-Sephadex C-25 con buffer acetato de amonio 0,05M, pH 7. La toxina produce contracción y parálisis en la extremidad inoculada de ratones albinos y se caracteriza por ser de naturaleza básica y tener un peso molecular de 4,5 kDa. Después de 45 minutos de ser inoculada en el músculo gastrocnemius de ratones albinos, Hm3 (30,4 µg) aumenta los niveles plasmáticos de creatina kinasa desde 252,6 UI/L hasta 3779,3 UI/L y de lactato deshidrogenasa, desde 142,7 UI/L hasta 248,2 UI/L; igualmente incrementa los niveles de calcio intramuscular desde 34,1 nmoles hasta 69,3 nmoles. Esta toxina carece de actividad proteolítica y fosfolipásica.

Aislamiento y caracterización parcial de una miotoxina del veneno de la serpiente Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) / Isolation and partial characterization of a myotoxin Bothrops atrox snake venom (Ophidia: Viperidae)

Se ha purificado una miotoxina del veneno de la serpiente Bothrops atrox, empleando una columna de intercambio catiónico de CM-Sephadex C-50 equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05M a pH 7. La miotoxina es una proteína básica, y por cromatografía de filtración y PAGE-SDS se ha determinado que tiene un peso molecular de 27 kDa, estando formada por dos cadenas polipeptídicas de 14 kDa cada una. La inoculación de la miotoxina en el músculo gastrocnemius de ratones albinos produce la liberación de creatina kinasa así como la necrosis del tejido. La miotoxina tiene actividad de fosfolipasa, anticoagulante y edemática, pero no hemolítica.

Separación e identificación de algunas toxinas del veneno de Centruroides margaritatus (Gervais, 1841) (Scorpiones: Buthidae) / Separation and identification of some toxins from Centruroides margaritatus venom (Gervais, 1841) (Scorpiones: Buthidae)

Las proteínas del veneno del escorpión Centruroides margaritatus, fueron separadas mediante cromatografía de intercambio catiónico en CM-Sephadex c-25 con buffer acetato de amonio 0,05M a pH 7 a partir de 28,3 mg de veneno obtenidos de 52 ejemplares adultos capturados en la provincia de Zarumilla, Tumbes, norte del Perú. El perfil cromatográfico mostró la presencia de 9 picos de proteína y los ensayos de toxicidad han permitido identificar tres tipos de toxinas, cada una específica para crustáceos, insectos y roedores, respectivamente. Tanto en el veneno crudo como en las fracciones colectadas, no se encontró actividad de fosfolipasa ni actividad proteolítica. La PAGE-SDS del veneno crudo, muestra la presencia de una banda bastante notoria de aproximadamente 14 KDa, y otras dos muy tenues, de aproximadamente 45 KDa, lo cual significa que la mayoría de proteínas de este veneno son de peso molecular igual o menor a 14KDa.

Acción de la toxina H13 sobre músculo esquelético / Action of toxin H13 on skeletal muscle

HI3 es una toxina que, en un trabajo anterior, fue aislada por nuestro grupo de investigación a partir del veneno del escorpión Hadruroides lunatus mediante cromatografía de intercambio iónico en CM-Sephadez C-25 a pH 7, y que se caracteriza por producir contracción y parálisis en la extremidad inoculada de ratones albinos. En este trabajo se ha determinado que la inoculacion de HI3 (26 µg) en el músculo gastrocenemius produce la liberación, en el plasma, de creatinina kanasa (CK) y lactado deshidrogenasa (LDH). La actividad de CK se incrementa desde 210 UI/L hasta 8015 UI/L luego de 60 minutos, mientras que la actividad de LDH aumentada desde 174 UI/L hasta 1697 UI/L luego de 90 minutos. Por PAGE-SDS, se ha demostrado que la incubación de HI3 (26 µg) con el músculo gastrocnemius aislado de ratones albinos, en medio fisiológico a pH, provoca también la liberación de otras proteínas musculares. Además, HI3 es capaz de incrementar más de 3,5 veces los niveles normales de calcio intramuscular, luego de 45 minutos de acción. Nuestros resultados sugieren que HI3 actúa específicamente a nivel muscular, afectando la permeabilidad del sarcolema y provocando la fuga de proteínas musculares. Además el incremento de los niveles de calcio podría generar hipercontracción y la destrucción de fibras musculares.

Acción de la miotoxina del veneno de Bothrops brazili Hoge, 1953 (Ophidia: Viperidae) / Action of the myotoxin from Bothrops brazili Hoge, 1953 snake venom (Ophidia: Viperidae)

Se ha estudiado el modo de acción de la miotoxina del veneno de la serpiente Bothrops brazili. La inoculación de la miotoxina en el músculo gastrocnemius de ratones albinos produce durante la primera hora de acción la liberación de creatinina kinasa y lactato deshidrogenasa, mientras que por PAGE-SDS, se revela que la incubación de la miotoxina con músculo gastrocnemius aislado, produce además la liberación de otras proteínas musculares. Asimismo, la miotoxina produce hipercontracción, lesiones delta e incrementa los niveles de calcio intramuscular, tanto in vivo como in vitro, lo cual no depende del ingreso de calcio extracelular vía receptores de dihidropiridina. Este incremento de calcio explicaría la hipercontracción observada y podría generar la activación de proteasa y lipasas endógenas dependientes de calcio, que conducirían a la necrosis muscular.

Purificación parcial de las toxinas HI1, HI2 y HI3 del veneno del escorpión Hadruroides lunatus Koch, 1867 (Scorpianida: Vejovidae) / Partial purification of toxins HI1, HI2 and HI3 from Hadruroides lunatus Koch, 1867 scorpion venom (Scorpionida: Vejovidae)

Se han separado las proteínas del veneno de escorpión Hadruroides lunatus, por cromatografía de intercambio iónico en CM-Sephadex C-25 con buffer acetato de amonio 0,05M, pH 7, y se obtuvieron seis picos de proteína. Los ensayos de toxicidad de las fracciones colectadas han permitido identificar 3 toxinas que hemos denominado H11, H12, y H13, las cuales paralizan, respectivamente, insectos (Grillus sp.), crustáceos (Porcellio laevis) y la extremidad inoculada de ratones albinos. Las tres toxinas son de naturaleza básica, y carece de actividad proteolítica y fosfolipásica. Adicionalmente, H13 aumenta los niveles plasmáticos de creatinina kinasa, luego de ser inoculadas en el músculo gastrocnemius de ratones albinos. Por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGES-SDS), se ha determinado que H13 muestra una sola banda proteica de 12,5 KDa, mientras que las otras toxinas poseen contaminantes proteicos.

Aislamiento y caracterización de una miotoxina del veneno de la serpiente Bothrops brazili Hoge. 1953 (Ophidia: Viperidae) / Isolation and characterization of a myotoxin from Bothrops brazili Hoge, 1953 sanke venom (Ophidia: Viperidae)

Se ha purificado una miotoxina del veneno de la serpiente Bathorops brazili, empleando un solo paso cromatográfico de intercambio iónico sobre CM-Sephadex C-50 con buffer acetato de amonio 0,05 M pH 7. La pureza de la proteína fue evaluada por PAGE con y sin SDS, inmunodifusión e inmuelectroforesis. La proteína es de naturaleza básica y contiene 15,6 por ciento de Lys+Arg; además, no está glicosilada, carece de actividad enzimática, y por el método de Lowry se ha calculado que ella constituye el 25 por ciento de la proteína total del veneno. Por PAGE-SDS y cromatografía de filtración, se ha determinado que la miotoxina tiene un peso molecular de 30 KDa, y está formada por 2 cadenas polipeptídicas de 15 KDa cada una. La inoculación de la miotoxina en el músculo gastrocnemius de ratones albinos, produce una severa necrosis del tejido. La miotoxina no tiene actividad hemolítica ni anticoagulante; sin embargo, sí produce edema, se ha calculado una DEM de 32,6 µg de proteína.

Purificación de una enzima proteolítica del veneno de Bothrops brazili y estudio de su actividad sobre fibrinógeno / Purification of a proteolytic enzyme from the venom of Bothrops brazili snake and study of its activity on fibrinogen

Se ha aislado una enzima proteolítica del veneno de la serpiente peruana brazili, por cromatografía en Sephadex G-100 y CM-Sephadex C-50, con buffer acetato de aminio 0.05 M pH 7,0. La enzima fue purificada 3,2 veces con un rendimiento de 52,5 por ciento y el peso molecular calculado por filtración en gel fue de 18 000, mientras que la PAGES-SDS permitió observar una sola banda proteica de 22 000 daltons en condiciones reductoras y de 20 300 daltons en condiciones no reductoras, determinándose que la enzima es de una sola cadena polipeptídica con al menos un enlace disulfuro. La enzima hidroliza fibrinógeno, fibrina, caseína y albumina, pero no hemoglobina ni mioglobina. Por su acción sobre el fibrinógeno y luego la cadena Bß. Esta actividad es inhibida por EDTA pero no por PMSF, TLCK, iodoacetato y pepstatin, indicando que se trata de una metaloproteinasa; sin embargo, los iones Ca++, Mg++ y Zn++ no restablecen la actividad. Finalmente, la enzima es estable hasta los 45°C y en su acción sobre fibrina, la hidrólisis se da preferencialmente sobre la cadena alfa.