RESUMO
TAP-p15 heterodimers have been implicated in the export of mRNAs through nuclear pore complexes (NPCs). We report a structural analysis of the interaction domains of TAP and p15 in a ternary complex with a Phe-Gly (FG) repeat of an NPC component. The TAP-p15 heterodimer is structurally similar to the homodimeric transport factor NTF2, but unlike NTF2, it is incompatible with either homodimerization or Ran binding. The NTF2-like heterodimer functions as a single structural unit in recognizing an FG repeat at a hydrophobic pocket present only on TAP and not on p15. This FG binding site interacts synergistically with a second site at the C terminus of TAP to mediate mRNA transport through the pore. In general, our findings suggest that FG repeats bind with a similar conformation to different classes of transport factors.
Assuntos
Transportadores de Cassetes de Ligação de ATP/química , Transporte Ativo do Núcleo Celular/fisiologia , Proteínas de Transporte/química , Poro Nuclear/química , Proteínas Nucleares/química , Proteínas de Transporte Nucleocitoplasmático , RNA Mensageiro/metabolismo , Membro 2 da Subfamília B de Transportadores de Cassetes de Ligação de ATP , Transportadores de Cassetes de Ligação de ATP/metabolismo , Sequência de Aminoácidos , Animais , Sítios de Ligação , Proteínas de Transporte/genética , Proteínas de Transporte/metabolismo , Cristalografia por Raios X , Dimerização , Humanos , Modelos Moleculares , Dados de Sequência Molecular , Mutagênese Sítio-Dirigida , Poro Nuclear/metabolismo , Proteínas Nucleares/genética , Proteínas Nucleares/metabolismo , Ligação Proteica , Estrutura Terciária de Proteína , RNA Mensageiro/genética , Proteínas Recombinantes de Fusão/genética , Proteínas Recombinantes de Fusão/metabolismo , Alinhamento de Sequência , Proteína ran de Ligação ao GTP/metabolismoRESUMO
Using the human basal transcription factors TFIID and TFIIH as examples, we show that pairwise coexpression of polypeptides in Escherichia coli can be used as a tool for the identification of specifically interacting subunits within multiprotein complexes. We find that coexpression of appropriate combinations generally leads to an increase in the solubility and stability of the polypeptides involved, which means that large amounts of the resulting complexes can immediately be obtained for subsequent biochemical and structural analysis. Furthermore, we demonstrate that the solubilization and/or the proper folding of a protein by its natural partner can be used as a monitor for deletion mapping to determine precise interaction domains. Coexpression can be used as an alternative or complementary approach to conventional techniques for interaction studies such as yeast two-hybrid analysis, GST pulldown and immunoprecipitation.
Assuntos
Escherichia coli/genética , Fatores de Transcrição TFII/química , Fatores de Transcrição TFII/metabolismo , Fatores de Transcrição/química , Fatores de Transcrição/metabolismo , Sítios de Ligação , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/genética , Humanos , Substâncias Macromoleculares , Modelos Moleculares , Ligação Proteica , Dobramento de Proteína , Estrutura Quaternária de Proteína , Subunidades Proteicas , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Deleção de Sequência , Solubilidade , Fator de Transcrição TFIID , Fator de Transcrição TFIIH , Fatores de Transcrição/genética , Fatores de Transcrição TFII/genética , Técnicas do Sistema de Duplo-HíbridoRESUMO
TFIIH is a multiprotein complex required for both transcription and DNA repair. Single particles of human TFIIH were revealed by electron microscopy and image processing at a resolution of 3.8 nm. TFIIH is 16 x 12.5 x 7.5 nm in size and is organized into a ring-like structure from which a large protein domain protrudes out. A subcomplex assembled from five recombinant core subunits also forms a circular architecture that can be superimposed on the ring found in human TFIIH. Immunolabeling experiments localize several subunits: p44, within the ring structure, forms the base of the protruding protein density which includes the cdk7 kinase, cyclin H, and MAT1. Within the ring structure, p44 was flanked on either side by the XPB and XPD helicases. These observations provide us with a quartenary organizational model of TFIIH.
Assuntos
Quinases Ciclina-Dependentes , DNA Helicases/química , DNA Helicases/ultraestrutura , Fatores de Transcrição TFII , Fatores de Transcrição/química , Fatores de Transcrição/ultraestrutura , Anticorpos Monoclonais , Ciclina H , Ciclinas/química , Ciclinas/metabolismo , Ciclinas/ultraestrutura , DNA Helicases/metabolismo , Proteínas de Ligação a DNA/química , Proteínas de Ligação a DNA/metabolismo , Proteínas de Ligação a DNA/ultraestrutura , Células HeLa , Humanos , Processamento de Imagem Assistida por Computador , Substâncias Macromoleculares , Microscopia Imunoeletrônica , Modelos Moleculares , Complexos Multiproteicos , Proteínas Serina-Treonina Quinases/química , Proteínas Serina-Treonina Quinases/metabolismo , Proteínas Serina-Treonina Quinases/ultraestrutura , Estrutura Quaternária de Proteína , Proteínas/química , Proteínas/metabolismo , Proteínas/ultraestrutura , RNA Mensageiro/biossíntese , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Proteínas Recombinantes/ultraestrutura , Fator de Transcrição TFIIH , Fatores de Transcrição/metabolismo , Transcrição Gênica , Proteína Grupo D do Xeroderma Pigmentoso , Quinase Ativadora de Quinase Dependente de CiclinaRESUMO
In an effort to understand the structure function relationship of TFIIH, a transcription/repair factor, we focused our attention on the p44 subunit, which plays a central role in both mechanisms. The amino-terminal portion of p44 has been shown to be involved in the regulation of the XPD helicase activity; here we show that its carboxyl-terminal domain is essential for TFIIH transcription activity and that it binds three zinc atoms through two independent modules. The first contains a C4 zinc finger motif, whereas the second is characterized by a CX(2)CX(2-4)FCADCD motif, corresponding to interleaved zinc binding sites. The solution structure of this second module reveals an unexpected homology with the regulatory domain of protein kinase C and provides a framework to study its role at the molecular level.
Assuntos
Cisteína , Fatores de Transcrição TFII , Fatores de Transcrição/química , Fatores de Transcrição/metabolismo , Dedos de Zinco , Sequência de Aminoácidos , Animais , Sítios de Ligação , Cisteína/genética , Cisteína/metabolismo , DNA Helicases/química , DNA Helicases/genética , DNA Helicases/metabolismo , Histidina/genética , Histidina/metabolismo , Humanos , Espectrometria de Massas , Modelos Moleculares , Dados de Sequência Molecular , Mutação , Ressonância Magnética Nuclear Biomolecular , Ligação Proteica , Proteína Quinase C/química , Estrutura Secundária de Proteína , Estrutura Terciária de Proteína , Subunidades Proteicas , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Alinhamento de Sequência , Relação Estrutura-Atividade , Fator de Transcrição TFIIH , Fatores de Transcrição/genética , Transcrição Gênica , Zinco/metabolismoRESUMO
In most cases, xeroderma pigmentosum group D (XP-D) and trichothiodystrophy (TTD) patients carry mutations in the carboxy-terminal domain of the evolutionarily conserved helicase XPD, which is one of the subunits of the transcription/repair factor TFIIH (refs 1,2). In this study, we demonstrate that XPD interacts specifically with p44, another subunit of TFIIH, and that this interaction results in the stimulation of 5'-->3' helicase activity. Mutations in the XPD C-terminal domain, as found in most patients, prevent the interaction with p44, thus explaining the decrease in XPD helicase activity and the nucleotide excision repair (NER) defect.
Assuntos
DNA Helicases/genética , Reparo do DNA , Proteínas de Ligação a DNA , Doenças do Cabelo/genética , Proteínas/genética , Fatores de Transcrição TFII , Fatores de Transcrição/metabolismo , Xeroderma Pigmentoso/genética , DNA Helicases/metabolismo , Humanos , Mutação , Conformação Proteica , Proteínas/metabolismo , Fator de Transcrição TFIIH , Proteína Grupo D do Xeroderma PigmentosoRESUMO
Poly-ADP ribosylation of nuclear proteins is activated when poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), a nuclear zinc-finger enzyme, binds to single-strand DNA breaks. To understand how the signal emerging from its DNA-binding domain (DBD) bound to such breaks is transduced to its catalytic domain, the structure-function relationship of the DBD was investigated. We have used mutagenesis by the polymerase chain reaction (PCR) to generate a random library of PARP mutants. In this work, we describe the identification of catalytically inactive mutants bearing single point mutations, located outside the two zinc fingers in the DBD, that have conserved their full capacity to bind DNA. The results obtained demonstrate that the DNA-dependent activation of PARP requires not only a capacity to bind DNA but also a number of crucial residues to maintain a conformation of the domain necessary to transfer an 'activation signal' to the catalytic domain.
Assuntos
Proteínas de Ligação a DNA/metabolismo , Poli(ADP-Ribose) Polimerases/metabolismo , Catálise , Proteínas de Ligação a DNA/genética , Escherichia coli/genética , Humanos , Mutagênese , Poli(ADP-Ribose) Polimerases/genética , Ligação Proteica , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Relação Estrutura-AtividadeRESUMO
Dissection of the human poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) molecule in terms of its structure-function relationship has proved to be an essential step towards understanding the biological role of poly(ADP-ribosylation) as a cellular response to DNA damage in eukaryotes. Current approaches aimed at elucidating the implication of this multifunctional enzyme in the maintenance of the genomic integrity will be presented.