Disruption of a Novel Iron Transport System Reverses Oxidative Stress Phenotypes of a dpr Mutant Strain of Streptococcus mutans.

The Dps-like peroxide resistance protein (Dpr) is essential for H2O2 stress tolerance and aerobic growth of the oral pathogen Streptococcus mutans Dpr accumulates during oxidative stress, protecting the cell by sequestering iron ions and thereby preventing the generation of toxic hydroxyl radicals that result from the interaction of iron with H2O2 Previously, we reported that the SpxA1 and SpxA2 regulators positively regulate expression of dpr in S. mutans Using an antibody raised against S. mutans Dpr, we confirmed at the protein level the central and cooperative nature of SpxA1 and SpxA2 regulation in Dpr production. During phenotypic characterization of the S. mutans Δdpr strain, we observed the appearance of distinct colony variants, which sometimes lost the oxidative stress sensitivity typical of Δdpr strains. Whole-genome sequencing of these phenotypically distinct Δdpr isolates revealed that a putative iron transporter operon, smu995-smu998, was a genomic hot spot with multiple single nucleotide polymorphisms identified within the different isolates. Deletion of smu995 or the entire smu995-smu998 operon in the Δdpr background strain completely reversed the oxidative stress-sensitive phenotypes associated with dpr inactivation. Conversely, inactivation of genes encoding the ferrous iron transport system FeoABC did not alleviate phenotypes of the Δdpr strain. Preliminary characterization of strains lacking smu995-smu998, feoABC, and the iron/manganese transporter gene sloABC revealed the interactive nature of these three systems in iron transport but also indicated that there may be additional iron uptake systems in S. mutansIMPORTANCE The dental caries-associated pathogen Streptococcus mutans routinely encounters oxidative stress within the human plaque biofilm. Previous studies revealed that the iron-binding protein Dpr confers protection toward oxidative stress by limiting free iron availability, which is associated with the generation of toxic hydroxyl radicals. Here, we report the identification of spontaneously occurring mutations within Δdpr strains. Several of those mutations were mapped to the operon smu995-smu998, revealing a previously uncharacterized system that appears to be important in iron acquisition. Disruption of the smu995-smu998 operon resulted in reversion of the stress-sensitive phenotype typical of a Δdpr strain. Our data suggest that the Smu995-Smu998 system works along with other known metal transport systems of S. mutans, i.e., FeoABC and SloABC, to coordinate iron uptake.

Transcriptional and Phenotypic Characterization of Novel Spx-Regulated Genes in Streptococcus mutans.

In oral biofilms, two of the major environmental challenges encountered by the dental pathogen Streptococcus mutans are acid and oxidative stresses. Previously, we showed that the S. mutans transcriptional regulators SpxA1 and SpxA2 (formerly SpxA and SpxB, respectively) are involved in stress survival by activating the expression of classic oxidative stress genes such as dpr, nox, sodA and tpx. We reasoned that some of the uncharacterized genes under SpxA1/A2 control are potentially involved in oxidative stress management. Therefore, the goal of this study was to use Spx-regulated genes as a tool to identify novel oxidative stress genes in S. mutans. Quantitative real-time PCR was used to evaluate the responses of ten Spx-regulated genes during H2O2 stress in the parent and Δspx strains. Transcription activation of the H2O2-induced genes (8 out of 10) was strongly dependent on SpxA1 and, to a lesser extent, SpxA2. In vitro transcription assays revealed that one or both Spx proteins directly regulate three of these genes. The gene encoding the FeoB ferrous permease was slightly repressed by H2O2 but constitutively induced in strains lacking SpxA1. Nine genes were selected for downstream mutational analysis but inactivation of smu127, encoding a subunit of the acetoin dehydrogenase was apparently lethal. In vitro and in vivo characterization of the viable mutants indicated that, in addition to the transcriptional activation of reducing and antioxidant pathways, Spx performs an important role in iron homeostasis by regulating the intracellular availability of free iron. In particular, inactivation of the genes encoding the Fe-S biogenesis SUF system and the previously characterized iron-binding protein Dpr resulted in impaired growth under different oxidative stress conditions, increased sensitivity to iron and lower infectivity in rats. These results serve as an entryway into the characterization of novel genes and pathways that allow S. mutans to cope with oxidative stress.

Action of essential oils from Brazilian native and exotic medicinal species on oral biofilms.

BACKGROUND: Essential oils (EO) obtained from twenty medicinal and aromatic plants were evaluated for their antimicrobial activity against the oral pathogens Candida albicans, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus sanguis and Streptococcus mitis. METHODS: The antimicrobial activity of the EO was evaluates by microdilution method determining Minimal Inhibitory Concentration. Chemical analysis of the oils compounds was performed by Gas chromatography-mass spectrometry (CG-MS). The most active EO were also investigated as to their actions on the biolfilm formation. RESULTS: The most of the essential oils (EO) presented moderate to strong antimicrobial activity against the oral pathogens (MIC--Minimal Inhibitory Concentrations values between 0.007 and 1.00 mg/mL). The essential oil from Coriandrum sativum inhibited all oral species with MIC values from 0.007 to 0.250 mg/mL, and MBC/MFC (Minimal Bactericidal/Fungicidal Concentrations) from 0.015 to 0.500 mg/mL. On the other hand the essential oil of C. articulatus inhibited 63.96% of S. sanguis biofilm formation. Through Scanning Eletronic Microscopy (SEM) images no changes were observed in cell morphology, despite a decrease in biofilm formation and changes on biofilm structure. Chemical analysis by Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) of the C. sativum essential oil revealed major compounds derivatives from alcohols and aldehydes, while Cyperus articulatus and Aloysia gratissima (EOs) presented mono and sesquiterpenes. CONCLUSIONS: In conclusion, the crude oil from C. articulatus exhibited the best results of antimicrobial activity e ability to control biofilm formation. The chemical analysis showed the presence of terpenes and monoterpenes such as a-pinene, a-bulnesene and copaene. The reduction of biofilms formation was confirmed from SEM images. The results of this research shows a great potential from the plants studied as new antimicrobial sources.

Manometria anorretal em crianças com distúrbios evacuatórios / Anorectal manometry in children with evacuation disturbances

Objetivo: Estudar o impacto da manometria anorretal na avaliação da incontinência fecal e no diagnóstico da doença de Hirschsprung, na Unidade de Gastroenterologia do Departamento de Pediatria (HCRPUSP). Método: Análise retrospectiva dos prontuários de 130 crianças submetidas à manometria anorretal para investigação de constipação intestinal (grupo I) e de incontinência fecal (grupo II), correlacionando os achados manométricos, avaliação ao enema opaco, biópsia retal e evolução clínica. Resultados: No grupo I, o enema opaco foi normal em 55%, a manometria anorretal evidenciou reflexo retoesfincteriano em 80% e a biópsia anorretal mostrou neurônios em 52%. Mediante esses exames e evolução clínica foi possível subdividir as crianças em: com constipação funcional (87), com doença de Hirschsprung (11) e com pseudo-obstrução intestinal (cinco). As 12 crianças restantes tinham estomias, em oito, decorrentes de enterocolite e em quatro, como tratamento provisório de malformação anorretal. Nessas crianças, a avaliação conjunta com enema opaco, manometria e biópsia anorretais possibilitou descartar Hirschsprung. As crianças do grupo II apresentavam meningomielocele (uma), escape fecal (duas), pós-operatório de malformação anorretal (sete), pós-operatório de doença de Hirschsprung (três) e diarréia crônica (duas). A pressão basal anal média em uma criança no pós-operatório de malformação anorretal foi de 50mmHg e, em duas, menos de 20mmHg. Em uma criança com pós-operatório de Hirschsprung a pressão foi de 52mmHg e nas crianças com escape fecal, de 55mmHg. Conclusões: A manometria anorretal é um excelente método na investigação dos distúrbios intestinais na infância. Deve ser utilizada na tentativa da exclusão da doença de Hirschsprung e na avaliação da incontinência fecal, pois, quando é normal, pode, na maioria dos casos, evitar a realização de exames mais invasivos

Constipação intestinal na criança / Constipation in children

Apresentar uma revisão sobre a constipação intestinal na criança, analisando as principais características clínicas bem como sua abordagem diagnóstica e terapêutica. Métodos -Revisão bibliográfica atualizada e experiência da Unidade de Gastroenterologia do Departamento de Pediatria- HCRP- USP. Resultados - A constipação intestinal constitui um problema comum na prática pediátrica. Sua definição está baseada na eliminação de fezes ressecadas, com esforço e dor. É comum as crianças pequenas apresentarem choro durante as evacuações. Em algumas crianças, pode ser observada retenção fecal importante, com ou sem escape fecal. O diagnóstico, na maioria dos casos, pode ser feito através de dados de história clínica e exame físico cuidadoso dos pacientes. O tratamento deve ser direcionado à causa básica, necessitando, na maioria dos casos, mudanças dietéticas e comportamentais. Conclusões - O diagnóstico da constipação intestinal deve ser precoce, pois interfere no sucesso terapêutico, que depende de uma adequada alimentação e do recondicionamento esfincteriano

Estudo retrospectivo de 53 crianças com doença de Hirschsprung: achados clínicos e laboratoriais / Retrospective study of 53 children with Hirschsprung's disease: clinical and laboratorial findings

Objetivo: analisar algumas características clínicas e laboratoriais de crianças com doença de Hirschsprung. Métodos: estudo retrospectivo de 53 crianças com diagnóstico final de doença de Hirschsprung, atendidas de janeiro de 1981 a dezembro de 1999, no Hospital das Clínicas/ USP, Ribeiräo Preto. Foram analisados alguns parâmetros clínicos (distribuiçäo segundo o gênero, idade no início dos sinais e sintomas, na 1ª consulta e no diagnóstico da doença, principais sinais e sintomas e estado nutricional) e laboratoriais da 1ª consulta, que permitiram o diagnóstico (enema opaco, manometria anorretal e biópsia retal), bem como a evoluçäo dos pacientes após o tratamento cirúrgico. Resultados: 42 crianças (79,2 por cento) eram meninos. Os primeiros sinais e sintomas ocorreram no 1º mês, em 43 casos (81,1 por cento), a idade, na primeira consulta, teve mediana de 7 meses e idade de diagnóstico, mediana de 8,8 meses. As principais manifestações clínicas foram: distensäo abdominal em 83,0 por cento, constipaçäo intestinal em 73,6 por cento, atraso na eliminaçäo do mecônio em 60,7 por cento dos casos. Näo foi evidenciado importante comprometimento ponderoestatural. O enema opaco mostrou zona de transiçäo em 47,2 por cento (17/36) e, na manometria anorretal, observou-se ausência de reflexo reto esfincteriano em 73,7 por cento (14/19). Todas as biópsias anorretais evidenciaram aganglionose. Uma das crianças foi submetida a tratamento clínico e 52 a tratamento cirúrgico. A colostomia foi realizada em 22/52 crianças (42,3 por cento) e o tratamento cirúrgico definitivo em 49, sendo, em 77,6 por cento, cirurgia de Duhamel Haddad, em 20,4 por cento, cirurgia de Soave e, em 2,0 por cento, cirurgia de Lestar Martin. As complicações pré-operatórias mais freqüentes foram obstruçäo intestinal em 28,3 por cento e enterocolite em 11,3 por cento dos casos. As principais complicações pós-operatórias da colostomia foram: eventraçäo e/ou prolapso e/ou estenose em 22,7 por cento dos casos e do tratamento cirúrgico definitivo: escape e/ou incontinência fecal em 28,6 por cento, infecçäo e/ou deiscência de ferida cirúrgica em 22,4 por cento e enterocolite e/ou diarréia em 20,4 por cento. Três crianças näo foram submetidas a tratamento cirúrgico definitivo. Dez crianças (18,9 por cento) obtiveram alta, 14 (26,4 por cento) continuam em seguimento ambulatorial e 27 (50,9 por cento) abandonaram o serviço após a cirurgia definitiva

Estudo do quadro pulmonar de pacientes com fibrose cística / Study of lung involvement in patients with cistic fibrosis

Objetivo: O trabalho teve por finalidade caracterizar o acometimento do aparelho respiratório de pacientes com fibrose cística a fim de termos um panorama do quadro pulmonar dos mesmos. Métodos: Avaliação de dados obtidos, retrospectivamente, de prontuários médicos e de resultados prospectivos de gasometria arterial e espirometria de 16 pacientes com fibrose cística fora do quadro de doença pulmonar agudizada, com idade maior ou igual a 6 anos, de ambos os sexos, seguidos no ambulatório de Pediatria do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP. Resultados: A mediana de idade dos pacientes foi de 114 meses (9 anos e 6 meses), com variação de 72 - 360 meses. 68,75 por cento são do sexo masculino. A tosse produtiva foi o sintoma foi o sintoma mais freqüente (75 por cento da população estudada). 100 por cento dos indivíduos possuem cultura de catarro positiva de longa data (pelo menos 1 ano), sendo 81,25 por cento por Pseudomonas aeruginosa. A gasometria arterial revelou alguma anormalidade em 81,25 por cento dos indivíduos e a espirometria em 56,25 por cento dos indivíduos. Conclusão: Todos os pacientes analisados apresentam pelo menos um tipo de alteração pulmonar. A gasometria arterial detectou maior número de pacientes com alteração na função pulmonar do que a espirometria, porém os dois exames complementam-se para uma boa avaliação funcional pulmonar

Colestase neonatal e infecçäo por citomegalovírus: formas de apresentaçäo clínica e histopatológica / Neonatal cholestasis and cytomegalovirus infection: clinical and histopathologic forms

A infecçäo pelo citomegalovírus é sintomática em apenas 10 por cento dos casos. Os achados mais freqüentes säo a colestase e a hepatoesplenomegalia. Foram estudados 10 pacientes que apresentavam quadro de colestase neonatal associada à infecçäo pelo citomegalovírus. A maioria apresentava aumento de aminotransferases e alteraçöes discretas na funçäo hepática. Os achados histopatológicos foram de normalidade, hepatite de células gigantes, proliferaçäo de ductos biliares (confundindo com a atresia de vias biliares extra-hepáticas) e ductopenia. A evoluçäo dos pacientes foi variável, desde desaparecimento dos sintomas (2 pacientes) até óbito (2 pacientes). Pela possibilidade do quadro histopatológico se confundir com o da atresia de vias biliares extra-hepáticas, é necessário que a investigaçäo da causa da colestase neonatal, incluindo a pesquisa para infecçäo pelo citomegalovírus, seja realizada o mais rápido possível.