Marcación de un anticuerpo monoclonal con 99mTc por medio del grupo 99cTcN: evaluación de un modelo biológico / 99mTC labeling of a monoclonal antibody via a 99mTcN group: a biological model evaluation

El anticuerpo monoclonal (AcMo) anti-CEA B2C114 fue marcado con 99mTc utilizando uno de los métodos directos de marcación, en el cual la proteína (AcMo IgG1) se reuce utilizando una solución de Ditiotreitol (DTT) para generar grupos sulfhidrilos, uniendo el 99mTc a los mismos a través del anión [99mTcNCl4]- preparado por calentamiento a reflujo de pertecneciato en presencia de azida sódica y HCl conc. El exceso de DTT se eliminó pasando el AcMo reducido por Sephadex G-25 y del mismo modo se realizó la purificación del anticuerpo marcado. Las cromatografías en TLC y Whatman Nº1 usando Metanol 85 por ciento y solución fisiológica como solventes, mostraron una actividad unida a proteínas entre 55-60 por ciento, obteniéndose luego de la purificación por Sephadex G-25 un producto con 90-95 por ciento de pureza radioquímica. Se realizó la biodistribución en ratones Balb/c a las 21 h post inyección obteniéndose una relación de 2:1 de la dosis inyectada por gramo de tejido, con respecto al tumor reactivo:no reactivo. El ensayo de unión realizado demostró que el AcMo conservó su actividad biológica después de marcado

Marcación de un anticuerpo monoclonal con 99mTc por medio del grupo 99cTcN: evaluación de un modelo biológico / 99mTC labeling of a monoclonal antibody via a 99mTcN group: a biological model evaluation

El anticuerpo monoclonal (AcMo) anti-CEA B2C114 fue marcado con 99mTc utilizando uno de los métodos directos de marcación, en el cual la proteína (AcMo IgG1) se reuce utilizando una solución de Ditiotreitol (DTT) para generar grupos sulfhidrilos, uniendo el 99mTc a los mismos a través del anión [99mTcNCl4]- preparado por calentamiento a reflujo de pertecneciato en presencia de azida sódica y HCl conc. El exceso de DTT se eliminó pasando el AcMo reducido por Sephadex G-25 y del mismo modo se realizó la purificación del anticuerpo marcado. Las cromatografías en TLC y Whatman Nº1 usando Metanol 85 por ciento y solución fisiológica como solventes, mostraron una actividad unida a proteínas entre 55-60 por ciento, obteniéndose luego de la purificación por Sephadex G-25 un producto con 90-95 por ciento de pureza radioquímica. Se rea

Immunological characterization of blood group A epitopes expressed on cells and tissues with a monoclonal anti-CEA antibody.

BACKGROUND AND METHODS: Monoclonal antibodies (mAb) specific for the oligosaccharide epitopes of glycoproteins or glycolipids, such as blood group antigens, are powerful tools for studying the antigenic structure of normal and pathological cells and tissues. Anti-A human red blood cell monoclonal antibodies were produced by immunizing mice with normal cells, but only a few fulfilled the conditions necessary for revealing qualitative differences among A-antigens. Only those produced by hybridomas obtained from mice immunized with human tumor antigens specifically recognize A1 and A2 blood group antigens. We report here several immunological properties of the A-antigen defined by a mAb raised against the tumor-associated carcinoembryonic antigen. RESULTS AND CONCLUSIONS: The hybridoma B2C114, obtained as a result of the fusion of spleen cells from mice immunized with the carcinoembryonic antigen and a murine myeloma cell line, produces a mAb which reacts specifically against erythrocytes bearing the A blood-group antigen. The monoclonal antibody showed a high stability and a low dissociation rate from the antigen/antibody complex formed with adult A1, A2, A2B and cord blood samples. The antibody was able not only to discriminate between A1- and A2-RBC but also to detect kinetic differences among A-sites. On the one hand B2C114, reactive with the glycosidic moiety of the A-antigen, can discern at least two qualitatively different epitopes expressed on the A1-RBC surface, with a total number of A sites that is in close agreement with the figures already described for A1-RBC. On the other hand, A2-RBC shows a single phenotype that is kinetically similar to A1-low affinity binding sites. This antibody also labelled spontaneous and chemically-induced murine tumors as well as human tumors. Its reactivity with colon carcinoma frozen specimens obtained from O- and B-blood group patients indicated expression of an incompatible A-antigen. The immunochemical properties of B2C114 described here give support to our purpose of employing this mAb as a blood group reagent as well as a histopathological probe for in vitro and in vivo cancer diagnosis.

Marcación del anticuerpo monoclonal B2C114 con 111In usando un quelante funcional / 111In labelling of B2C114 monoclonal antibody with a bifunctional chelating agent

El anticuerpo monoclonal (AcMo) B2C114, dirigido contra el antígeno carcinoembrionario (CEA) fue conjugado con el anhídrido bicíclico del DTPA (CA-DTPA) usando diferentes relaciones molares CA-DTPA: AcMo desde 1:1 hasta 30:1. Se determinó para cada caso la eficiencia de acoplamiento y el número de moléculas de DTPA por molécula de AcMo. Se realizó la marcación con 111In para todas las relaciones molares CA-DTPA: AcMo y se determinó la pureza radioquímica por cromatografía instantánea en placa delgada (ITLC Gelman SG) y cromatografía en gel (Sephadex G-25). La biodistribución del AcMo marcado en ratones normales Balb/c y en portadores de tumor reactivo (M3), a diferentes horas post-inyección, mostró una acumulación creciente en el tumor al cabo de 72 h, con captación en hígado y riñón. Se observó también que al aumentar la relación molar CA-DTPA se incrementó el porcentaje de radiactividad asociada al riñón, lo cual indicaría una mayor inestabilidad del radiofármaco

Marcación del anticuerpo monoclonal B2C114 con 111In usando un quelante funcional / 111In labelling of B2C114 monoclonal antibody with a bifunctional chelating agent

El anticuerpo monoclonal (AcMo) B2C114, dirigido contra el antígeno carcinoembrionario (CEA) fue conjugado con el anhídrido bicíclico del DTPA (CA-DTPA) usando diferentes relaciones molares CA-DTPA: AcMo desde 1:1 hasta 30:1. Se determinó para cada caso la eficiencia de acoplamiento y el número de moléculas de DTPA por molécula de AcMo. Se realizó la marcación con 111In para todas las relaciones molares CA-DTPA: AcMo y se determinó la pureza radioquímica por cromatografía instantánea en placa delgada (ITLC Gelman SG) y cromatografía en gel (Sephadex G-25). La biodistribución del AcMo marcado en ratones normales Balb/c y en portadores de tumor reactivo (M3), a diferentes horas post-inyección, mostró una acumulación creciente en el tumor al cabo de 72 h, con captación en hígado y riñón. Se observó también que al aumentar la relación molar CA-DTPA se incrementó el porcentaje de radiactividad asociada al riñón, lo cual indicaría una mayor inestabilidad del radiofármaco

Specific biodetection of a murine spontaneous mammary carcinoma with labelled anti-human blood group-A monoclonal antibody.

The expression of cell surface antigens of the spontaneous transplantable M3-murine tumour was studied by means of the monoclonal antibody (MAb) B2C114 which recognizes the human blood group-A carbohydrate antigen. Following radioiodination the MAb retained their immunoreactivity and demonstrated a significantly higher in vitro binding with isolated M3-tumour cells as compared with a control antibody. B2C114 revealed 10(6) antigenic sites per cell, with a constant affinity of 5.1 x 10(9)/M. Biodistribution studies showed that B2C114 discriminated between malignant tumour and mouse normal tissues. Radioimmunodetection of Balb/c mice bearing s.c. M3-tumour showed that tumour was specifically defined without subtraction 1 day after injection of the radiolabelled antibody.

Diseño y evaluación de un modelo para la radioinmunolocalización e inmunoterapia del cáncer / Design and evolution of a model for the radioimmunotargetting and immunotherapy of cancer

El anticuerpo mionoclonal B2C114 producido contra el antígeno carcinoembrionario reconoce un carbohidrato del antígeno A de grupo sanguineo humano. La expresión de este determinante antigénico se investigó en estirpes celulares del adenocarcinoma mamario espontáneo M3 y su derivada experimental MM3 de mayor capacidad metastatizante. La reactividad específica in vitro de B2C114 marcado con I a la 125 permitió determinar el número de epitopes antigénicos por celula M3 y la constante de asociación. La biodistribución del anticuerpo monoclonal mostró que I a la 125-B2C114 discriminó, con alta sensibilidad, entre el tumor M3, la variante MM3 y tejidos normales, confirmado por la obtención de imágenes positivas de M3 en cámara gamma. Estos estudios han permitido la obtención de un modelo que facilita el desarrollo de diferentes tecnologías aplicadas al diagnóstico y a la terapéutica del cáncer (AU)

Diseño y evaluación de un modelo para la radioinmunolocalización e inmunoterapia del cáncer / Design and evolution of a model for the radioimmunotargetting and immunotherapy of cancer

El anticuerpo mionoclonal B2C114 producido contra el antígeno carcinoembrionario reconoce un carbohidrato del antígeno A de grupo sanguineo humano. La expresión de este determinante antigénico se investigó en estirpes celulares del adenocarcinoma mamario espontáneo M3 y su derivada experimental MM3 de mayor capacidad metastatizante. La reactividad específica in vitro de B2C114 marcado con I a la 125 permitió determinar el número de epitopes antigénicos por celula M3 y la constante de asociación. La biodistribución del anticuerpo monoclonal mostró que I a la 125-B2C114 discriminó, con alta sensibilidad, entre el tumor M3, la variante MM3 y tejidos normales, confirmado por la obtención de imágenes positivas de M3 en cámara gamma. Estos estudios han permitido la obtención de un modelo que facilita el desarrollo de diferentes tecnologías aplicadas al diagnóstico y a la terapéutica del cáncer

Producción de un anticuerpo monoclonal para la detección de antígeno A del sistema ABO de grupos sanguíneos / Production of a monoclonal antibodies for the detection of antibody A of the ABO blood group system

Se demuestra en el presente trabajo la utilidad de anticuerpos monoclonales anti-grupo sanguíneo. A obtenidos a partir de un híbrido generado por fusión entre linfocitos de bazo de ratón inmunizado y células de mieloma. El clon productor del anticuerpo monoclonal, denominado B2/C114, fue propagado como tumor ascítico en ratones, lo que permitió su conservación y producción en gran escala. El reactivo obtenido es útil para la evaluación rutinaria de grupos sanguíneos, presentando gran avidez, estabilidad superior a 12 meses y alto título, condiciones que satisfacen ampliamente los requerimientos de seguridad diagnóstica y costo efectivo

Producción de un anticuerpo monoclonal para la detección de antígeno A del sistema ABO de grupos sanguíneos / Production of a monoclonal antibodies for the detection of antibody A of the ABO blood group system

Se demuestra en el presente trabajo la utilidad de anticuerpos monoclonales anti-grupo sanguíneo. A obtenidos a partir de un híbrido generado por fusión entre linfocitos de bazo de ratón inmunizado y células de mieloma. El clon productor del anticuerpo monoclonal, denominado B2/C114, fue propagado como tumor ascítico en ratones, lo que permitió su conservación y producción en gran escala. El reactivo obtenido es útil para la evaluación rutinaria de grupos sanguíneos, presentando gran avidez, estabilidad superior a 12 meses y alto título, condiciones que satisfacen ampliamente los requerimientos de seguridad diagnóstica y costo efectivo (AU)

An improved selection procedure for the rescue of hybridomas. A comparative study of methotrexate versus aminopterin.

Several of aminopterin's drawbacks such as photosensitivity and high toxicity prompted us to compare the ability of methotrexate to select for hybridomas. Assessing the effect of both drugs on X63/Ag 8.653 myeloma cells and hybrid cells secreting monoclonal antibodies by tritiated thymidine incorporation and percentage of viable cells, we have shown that methotrexate could be used in place of aminopterin for the rescue of hybrid cells in selective medium. In addition, methotrexate hybrids develop more rapidly and can therefore be processed earlier. The stability and low toxicity of methotrexate also favor its use in the selection of hybridomas.

Hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies against equine infectious anemia virus.

A monoclonal anti-equine infectious anemia virus (anti-EIAV) antibody (1B15) has been generated by fusion of X63 Ag 8.653 myeloma cells and spleen cells from mice hypersensitized with viral antigen p29. Ouchterlony double-diffusion analysis indicated that antibody 1B15 is of the IgG class. The specificity of the immune reaction for p29 was confirmed by cross-over immunoelectrophoresis and disc-gel electrophoresis. MAb 1B15 was used to devise a solid-phase 'capture' RIA for EIAV-p29 antigen. The antigen, bound by 1B15 adsorbed onto wells of flexible microtitre plates, was detected using a rabbit anti-p29 serum followed by a 125I-labelled tracer. The assay was applied to detected using a of virus in horse serum and infected cell culture fluids.

Monoclonal antibodies specific for carcinoembryonic antigen produced by hybridoma technology

El objetivo del presente trabajo fue la producción, caracterización y aplicación de anticuerpos monoclonales anti-antígeno carcinoembrionario. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 2 dosis ip de 5 y 10 microng de antígeno carcinoembrionario en adyuvante completo de Freund cada 30 días, y 3 dosis de refuerzo durante días consecutivos. Las células esplénicas fueron fusionadas con células de mieloma X63/Ag8.653 en presencia de polietilenglicol, y los híbridos rescatados en medio selectivo conteniendo hipoxantina-methotrexate-timidina. La detección de híbridos productores de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se realizó por radioinmunoanálisis en fase sólida, utilizando como trazador imunoglobulina de conejo anti-ratón marcada con 125I. Se obtuvo una eficiencia del 65% en crescimiento y del 13% en positividad. Los híbridos fueron clonados y estabilizados por miniclonado repetitivo, con un 65% de crecimiento y 40% de positividad. De 11 hibridomas productores se seleccionaron 3 que fueron inyectados en ratones BALB/c para la obtención de tumores ascíticos. La inmuno-especificidad de los anticuerpos monoclonales A4, A15 y A19 fue determinada por inmunoelectroforesis crozada, detectándose la formación de inmunoprecipitados específicos entre los anticuerpos monoclonales y el antígeno carcinoembrionario marcado con 125I. El anticuerpo monoclonal A4, de altas afinidad (K=1,60x10*10 litros/mol) fue activo en el radioinmunoensayo hasta la dilución 1: 10 000 testada, permitiendo detectar valores de aproximadamente 0,5ng/ml. En ensayos de competición contra el anticuerpo policlonal, el rango de inhibición obtenido fue del 28 al 35% utilizando antígeno purificado, y del 10 al 15% con sueros de pacientes afectados por cáncer de colon...

Monoclonal antibodies specific for carcinoembryonic antigen produced by hybridoma technology

El objetivo del presente trabajo fue la producción, caracterización y aplicación de anticuerpos monoclonales anti-antígeno carcinoembrionario. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 2 dosis ip de 5 y 10 microng de antígeno carcinoembrionario en adyuvante completo de Freund cada 30 días, y 3 dosis de refuerzo durante días consecutivos. Las células esplénicas fueron fusionadas con células de mieloma X63/Ag8.653 en presencia de polietilenglicol, y los híbridos rescatados en medio selectivo conteniendo hipoxantina-methotrexate-timidina. La detección de híbridos productores de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se realizó por radioinmunoanálisis en fase sólida, utilizando como trazador imunoglobulina de conejo anti-ratón marcada con 125I. Se obtuvo una eficiencia del 65% en crescimiento y del 13% en positividad. Los híbridos fueron clonados y estabilizados por miniclonado repetitivo, con un 65% de crecimiento y 40% de positividad. De 11 hibridomas productores se seleccionaron 3 que fueron inyectados en ratones BALB/c para la obtención de tumores ascíticos. La inmuno-especificidad de los anticuerpos monoclonales A4, A15 y A19 fue determinada por inmunoelectroforesis crozada, detectándose la formación de inmunoprecipitados específicos entre los anticuerpos monoclonales y el antígeno carcinoembrionario marcado con 125I. El anticuerpo monoclonal A4, de altas afinidad (K=1,60x10*10 litros/mol) fue activo en el radioinmunoensayo hasta la dilución 1: 10 000 testada, permitiendo detectar valores de aproximadamente 0,5ng/ml. En ensayos de competición contra el anticuerpo policlonal, el rango de inhibición obtenido fue del 28 al 35% utilizando antígeno purificado, y del 10 al 15% con sueros de pacientes afectados por cáncer de colon...(AU)