RESUMO
Basic-region leucine zipper (bZip) proteins contain a bipartite DNA-binding motif consisting of a leucine zipper dimerization domain and a basic region that directly contacts DNA. In all naturally occurring bZip proteins, the basic region is positioned N-terminal to the leucine zipper. We have designed a series of model bZip peptides in which the basic region of the yeast transcriptional activator GCN4 is placed C-terminal to its leucine zipper. DNA-binding studies demonstrate that the optimal reverse GCN4 (rGCN4) peptide is able to bind specifically and with wild-type affinity to DNA despite this unnatural arrangement of the two subdomains. These results suggest that a thermodynamic basis for the observed N-terminal positioning of the basic region relative to the dimerization domain is unlikely.
Assuntos
Proteínas de Ligação a DNA/genética , Proteínas de Ligação a DNA/metabolismo , Proteínas Fúngicas/genética , Proteínas Fúngicas/metabolismo , Zíper de Leucina/genética , Mutagênese Sítio-Dirigida , Proteínas Quinases/genética , Proteínas Quinases/metabolismo , Proteínas de Saccharomyces cerevisiae , Fatores de Transcrição/genética , Fatores de Transcrição/metabolismo , Sequência de Aminoácidos , Fatores de Transcrição de Zíper de Leucina Básica , Sequência Conservada/genética , Proteínas de Ligação a DNA/síntese química , Dimerização , Escherichia coli/genética , Proteínas Fúngicas/síntese química , Fatores de Ligação G-Box , Dados de Sequência Molecular , Fragmentos de Peptídeos/síntese química , Fragmentos de Peptídeos/genética , Fragmentos de Peptídeos/metabolismo , Ligação Proteica/genética , Isoformas de Proteínas/genética , Isoformas de Proteínas/metabolismo , Proteínas Quinases/síntese química , Estrutura Secundária de Proteína/genética , Estrutura Terciária de Proteína/genética , Proteínas Recombinantes/biossíntese , Proteínas Recombinantes/síntese química , Sequências Repetitivas de Aminoácidos/genética , Termodinâmica , Fatores de Transcrição/síntese químicaRESUMO
bZip transcription factors contain two regions that are required for DNA binding: a leucine zipper dimerization domain and a highly charged basic region that directly contacts DNA. The spacing between these subdomains is strictly conserved, and changes in this spacing result in a loss of function. Using an in vitro selection strategy, we have investigated the ability of a bZip protein with incorrect spacing between these two regions to bind specifically to DNA. Surprisingly, we find that although such a protein does not bind to its predicted site, it is possible to isolate a pool of DNAs that bind with very similar affinity to that of GCN4 for its optimum DNA site.
Assuntos
Proteínas de Ligação a DNA/metabolismo , DNA/metabolismo , Proteínas de Saccharomyces cerevisiae , Fatores de Transcrição/metabolismo , Sequência de Aminoácidos , Fatores de Transcrição de Zíper de Leucina Básica , Sítios de Ligação , Proteínas de Ligação a DNA/química , Ensaio de Desvio de Mobilidade Eletroforética , Proteínas Fúngicas/química , Proteínas Fúngicas/metabolismo , Fatores de Ligação G-Box , Zíper de Leucina , Dados de Sequência Molecular , Oligodesoxirribonucleotídeos/metabolismo , Fragmentos de Peptídeos , Ligação Proteica , Conformação Proteica , Proteínas Quinases/química , Proteínas Quinases/metabolismo , Relação Estrutura-Atividade , Fatores de Transcrição/química , LevedurasRESUMO
Recent structural studies have highlighted the importance of antiparallel coiled coils in nature. In addition, well-behaved, model antiparallel coiled coils have been designed and used for the reassembly of protein fragments and for the study of the energetic contributions of various interactions to helix orientation specificity. Finally, high-resolution structural data are available for designed helical bundles, allowing an evaluation of the success of state-of-the-art protein design efforts.
Assuntos
Conformação Proteica , Algoritmos , Animais , Proteínas de Bactérias/química , Bases de Dados Factuais , Previsões , Antígenos de Hepatite/química , Antígenos da Hepatite delta , Humanos , Modelos Moleculares , Proteína Quinase C , Proteínas Serina-Treonina Quinases/química , Estrutura Secundária de Proteína , Proteínas Tirosina Quinases/química , Proteínas de Ligação a RNA/química , Serina-tRNA Ligase/química , Espectrina/químicaRESUMO
bZip proteins contain a bipartite DNA-binding motif consisting of a "leucine zipper" dimerization domain and a highly charged "basic region" that directly contacts DNA. These transcription factors form dimeric complexes with each monomer recognizing half of a symmetric or nearly symmetric DNA site. We have found that the bZip protein GCN4 can also bind with high affinity to DNA sites containing only a single GCN4 consensus half-site. Because several recent lines of evidence have suggested a role for monomeric DNA binding by bZip proteins, we investigated the structure of the GCN4.half-site complex. Quantitative DNA binding and affinity cleaving studies support a model in which GCN4 binds as a dimer, with one monomer making specific contacts to the consensus half-site and the other monomer forming nonspecific contacts that are nonetheless important for binding affinity. We also examined the folding transition induced in the basic regions of this complex upon binding DNA. Circular dichroism (CD) studies demonstrate that the basic regions of both monomers are helical, suggesting that a protein folding transition may be required for both specific and nonspecific DNA binding by GCN4.