Identificación de especies de Leishmania por la técnica de amplificación al azar del ADN polimórfico / Identification of Leishmania species by the random amplified polymorphic DNA technique

INTRODUCCIÓN: la leishmaniosis ha sido clasificada por la Organización Mundial de la Salud como una de las enfermedades tropicales más importantes. El control de esta parasitosis es muy difícil, porque no existen vacunas y el tratamiento es tóxico e insatisfactorio. Es de crucial importancia establecer un método de diagnóstico oportuno junto a la identificación del parásito, lo cual incide en la selección del tratamiento adecuado y en el diseño de las medidas de control apropiadas. Recientemente, los avances en biología molecular han permitido la caracterización de especies de Leishmania por diferentes métodos. La técnica de ADN polimórfico amplificado al azar es una técnica simple para detectar el polimorfismo genético del ADN. OBJETIVO: estandarizar la técnica de ADN polimórfico amplificado al azar para su utilización en la tipificación de especies de Leishmania del Nuevo Mundo. MÉTODOS: empleando una concentración de cebador de 5 pmol, 75 ng de ADN molde, 2 mM de cloruro de magnesio y 2 U de Taq ADN polimerasa en 25 mL de reacción, se obtuvieron patrones de amplificación reproducibles. La técnica optimizada de ADN polimórfico amplificado al azar se empleó para determinar las diferencias genéticas entre 10 cepas de referencia de Leishmania, con la utilización de 6 juegos de cebadores comerciales diseñados al azar. La relación filogenética entre las especies estudiadas se determinó utilizando la estrategia de agrupaciones mediante el método de UPGMA. RESULTADOS: los cebadores OPA 3, 4 y 8 permitieron diferenciar las 10 cepas de referencia de Leishmania estudiadas. Se obtuvieron 2 grupos genéticos bien definidos donde se agrupan las especies del subgénero Leishmania y Viannia, respectivamente; los 2 subgéneros mostraron diferencias genéticas. CONCLUSIONES: de esta forma se cuenta en el laboratorio con la técnica del ADN polimórfico amplificado al azar optimizada para la identificación de especies de Leishmania.

INTRODUCTION: leishmaniosis has been regarded by the World Health Organization as one of the most important tropical diseases. It is very difficult to control such parasitosis because there are not vaccines, and therapy is generally toxic and unsatisfactory. It is of vital importance to set prompt diagnostic method along with identification of the parasite in order to select the suitable treatment and to design the most convenient control measures. Recently, the advances in molecular biology have made it possible to characterize Leishmania species by different methods. The random amplified polymorphic DNA technique is a simple method to detect the genetic polymorphic DNA. OBJECTIVE: to standardize the random amplified polymorphic DNA technique for its use in New World Leishmania species typing. METHODS: by using 5 pmol primer concentration, 75 ng of template DNA, 2 mM of magnesium chloride and 2 U of polymerase DNA Taq in 25µL reaction, two reproducible amplification patters were obtained. The optimized random amplified polymorphic DNA technique served to determine the genetic differences among ten reference strains of Leishmania, with 6 sets of randomly designed conventional primers. The UP GMA method-based grouping strategy determined the phylogenetic relation among the studied species. RESULTS: OPA primers -3, 4 and 8 allowed distinguishing the ten reference strains of Leishmania under study. Two well defined genetic groups including species of Leishmania and Viannia subgenres were obtained; these 2 subgenres showed genetic differences. CONCLUSIONS: in this way, our laboratory has the optimized random amplified polymorphic DNA for the identification of Leishmania species.

Identificación de especies de Leishmania por la técnica de amplificación al azar del ADN polimórfico / Identification of Leishmania species by the random amplified polymorphic DNA technique

INTRODUCCIÓN: la leishmaniosis ha sido clasificada por la Organización Mundial de la Salud como una de las enfermedades tropicales más importantes. El control de esta parasitosis es muy difícil, porque no existen vacunas y el tratamiento es tóxico e insatisfactorio. Es de crucial importancia establecer un método de diagnóstico oportuno junto a la identificación del parsito, lo cual incide en la selección del tratamiento adecuado y en el diseño de las medidas de control apropiadas. Recientemente, los avances en biología molecular han permitido la caracterización de especies de Leishmania por diferentes métodos. La técnica de ADN polimórfico amplificado al azar es una técnica simple para detectar el polimorfismo genético del ADN. OBJETIVO: estandarizar la técnica de ADN polimórfico amplificado al azar para su utilización en la tipificación de especies de Leishmania del Nuevo Mundo. MÉTODOS: empleando una concentración de cebador de 5 pmol, 75 ng de ADN molde, 2 mM de cloruro de magnesio y 2 U de Taq ADN polimerasa en 25 mL de reacción, se obtuvieron patrones de amplificación reproducibles. La técnica optimizada de ADN polimórfico amplificado al azar se empleó para determinar las diferencias genéticas entre 10 cepas de referencia de Leishmania, con la utilización de 6 juegos de cebadores comerciales diseñados al azar. La relación filogenética entre las especies estudiadas se determinó utilizando la estrategia de agrupaciones mediante el método de UPGMA. RESULTADOS: los cebadores OPA 3, 4 y 8 permitieron diferenciar las 10 cepas de referencia de Leishmania estudiadas. Se obtuvieron 2 grupos genéticos bien definidos donde se agrupan las especies del subgénero Leishmania y Viannia, respectivamente; los 2 subgéneros mostraron diferencias genéticas. CONCLUSIONES: de esta forma se cuenta en el laboratorio con la técnica del ADN polimórfico amplificado al azar optimizada para la identificación de especies de Leishmania(AU)

INTRODUCTION: leishmaniosis has been regarded by the World Health Organization as one of the most important tropical diseases. It is very difficult to control such parasitosis because there are not vaccines, and therapy is generally toxic and unsatisfactory. It is of vital importance to set prompt diagnostic method along with identification of the parasite in order to select the suitable treatment and to design the most convenient control measures. Recently, the advances in molecular biology have made it possible to characterize Leishmania species by different methods. The random amplified polymorphic DNA technique is a simple method to detect the genetic polymorphic DNA. OBJECTIVE: to standardize the random amplified polymorphic DNA technique for its use in New World Leishmania species typing. METHODS: by using 5 pmol primer concentration, 75 ng of template DNA, 2 mM of magnesium chloride and 2 U of polymerase DNA Taq in 25µL reaction, two reproducible amplification patters were obtained. The optimized random amplified polymorphic DNA technique served to determine the genetic differences among ten reference strains of Leishmania, with 6 sets of randomly designed conventional primers. The UP GMA method-based grouping strategy determined the phylogenetic relation among the studied species. RESULTS: OPA primers -3, 4 and 8 allowed distinguishing the ten reference strains of Leishmania under study. Two well defined genetic groups including species of Leishmania and Viannia subgenres were obtained; these 2 subgenres showed genetic differences. CONCLUSIONS: in this way, our laboratory has the optimized random amplified polymorphic DNA for the identification of Leishmania species(AU)

The Leishmania HSP20 is antigenic during natural infections, but, as DNA vaccine, it does not protect BALB/c mice against experimental L. amazonensis infection.

Protozoa of the genus Leishmania are causative agents of leishmaniasis, an important health problem in both human and veterinary medicine. Here, we describe a new heat shock protein (HSP) in Leishmania, belonging to the small HSP (sHSP) family in kinetoplastids. The protein is highly conserved in different Leishmania species, showing instead significant divergence with sHSP's from other organisms. The humoral response elicited against this protein during Leishmania infection has been investigated in natural infected humans and dogs, and in experimentally infected hamsters. Leishmania HSP20 is a prominent antigen for canine hosts; on the contrary, the protein seems to be a poor antigen for human immune system. Time-course analysis of appearance of anti-HSP20 antibodies in golden hamsters indicated that these antibodies are produced at late stages of the infection, when clinical symptoms of disease are patent. Finally, the protective efficacy of HSP20 was assessed in mice using a DNA vaccine approach prior to challenge with Leishmania amazonensis.

The Leishmania HSP20 Is Antigenic during Natural Infections, but, as DNA Vaccine, It does not Protect BALB/c Mice against Experimental L: amazonensis Infection

Protozoa of the genus Leishmania are causative agents of leishmaniasis, an important health problem in both human and veterinary medicine. Here, we describe a new heat shock protein (HSP) in Leishmania, belonging to the small HSP (sHSP) family in kinetoplastids. The protein is highly conserved in different Leishmania species, showing instead significant divergence with sHSP's from other organisms. The humoral response elicited against this protein during Leishmania infection has been investigated in natural infected humans and dogs, and in experimentally infected hamsters. Leishmania HSP20 is a prominent antigen for canine hosts; on the contrary, the protein seems to be a poor antigen for human immune system. Time-course analysis of appearance of anti-HSP20 antibodies in golden hamsters indicated that these antibodies are produced at late stages of the infection, when clinical symptoms of disease are patent. Finally, the protective efficacy of HSP20 was assessed in mice using a DNA vaccine approach prior to challenge with Leishmania amazonensis(AU)

Protozoos del género Leishmania son agentes causantes de la leishmaniasis, que es un importante problema de salud tanto en medicina humana y veterinaria. Aquí se describe una nueva proteína de choque térmico (HSP) de Leishmania, que pertenecen a la pequeña HSP (sHSP) en kinetoplastids familia. La proteína está altamente conservada en diferentes especies de Leishmania, mostrando importantes diferencias en lugar sHSP con la de otros organismos. La respuesta humoral contra esta proteína suscitado durante la infección por Leishmania se ha investigado en seres humanos infectados naturales y perros, y en hámsters infectados experimentalmente. Leishmania HSP20 es un antígeno para canina anfitriones, por el contrario, la proteína parece ser un pobre de antígenos para el sistema inmunitario humano. Curso de análisis de tiempo de aparición de anticuerpos anti-HSP20 en hamsters dorados indicó que estos anticuerpos se producen en etapas tardías de la infección, cuando los síntomas clínicos de la enfermedad son patentes. Por último, la eficacia protectora de HSP20 se evaluó en ratones utilizando una vacuna de ADN antes de enfoque desafío con Leishmania amazonensis

Efecto de derivados de la tiadiazina sobre la capacidad infectiva de promastigotes de Leishmania amazonensis / Effects of thiadiazine derivatives on the infective capacity of Leishamia amazonensis promastigotes

Se evaluó la capacidad infectiva de promastigotes de Leishmania amazonensis al ser tratados con una serie de 10 derivados de la tiadiazina. Los parásitos fueron incubados durante 24 h con 1 o 0,1 mg/mL de cada compuesto y posteriormente, se infectaron macrófagos peritoneales de ratones BALB/c en cultivos. Todos los compuestos causaron una reducción de la capacidad infectiva de los parásitos mayor que 50 %. El producto T1O fue el que causó un mayor efecto, disminuyendo la infección en 92,8 % de infección.

The infective capacity of Leishmania amazonensis promastigotes was evaluated after they were treated with a series of 10 thiadiazine derivatives. The parasites were incubated for 24 hours with 1 or 0,1 mg/ml of each compound and then, peritoneal macrophages from BALB/c mice were infected in cultures. All the compounds managed to reduce the infective capacity of parasites by more than 50%. T10 product exhibited the highest effect since it reduced infection by 92,8%.

Efecto de derivados de la tiadiazina sobre la capacidad infectiva de promastigotes de Leishmania amazonensis / Effects of thiadiazine derivatives on the infective capacity of Leishamia amazonensis promastigotes

Se evaluó la capacidad infectiva de promastigotes de Leishmania amazonensis al ser tratados con una serie de 10 derivados de la tiadiazina. Los parásitos fueron incubados durante 24 h con 1 o 0,1 mg/mL de cada compuesto y posteriormente, se infectaron macrófagos peritoneales de ratones BALB/c en cultivos. Todos los compuestos causaron una reducción de la capacidad infectiva de los parásitos mayor que 50 por ciento. El producto T1O fue el que causó un mayor efecto, disminuyendo la infección en 92,8 por ciento de infección(AU)

Evaluación de la autoinmunidad en ratones BALB/c inmunizados con una biblioteca genómica de expresión de Trypanosoma cruzi / Evaluation of autoimmunuty in Balb/c mice immunized with a genomic library of expression of Trypanosoma cruzi

Uno de los problemas de la seguridad para las vacunas de ADN es la inducción de fenómenos de autoinmunidad. Nosotros examinamos el efecto de la inmunización con ácidos nucleicos de Trypanosoma cruzi en la inducción de diferentes autoanticuerpos en ratones de Balb/c. Los animales fueron divididos en cinco grupos: los primeros cuatro recibieron diferentes esquemas: 25 µg de la biblioteca genómica de expresión (grupo L), 25 µg de antígenos solubles de T. cruzi (grupo T), 25 µg del plásmido pcDNA3 (grupo P), 25 µg de genómica ADN de T. cruzi (grupo G) y un grupo control de animales no inmunizados. Los anticuerpos antinucleares y anticuerpos contra músculo cardíaco fueron evaluados por immunofluorescencia indirecta y los anticuerpos anti ADN de doble, simple cadena y el anti IgG factor reumatoideo fueron determinados semanalmente por ELISA. La vacunación no provocó la inducción de anticuerpos anti ADN de doble o simple cadena, anticuerpos antinucleares ni contra músculo cardíaco. Se observó un aumento transitorio del Factor Reumatoideo IgG en los ratones inmunizados con la biblioteca genómica de expresión de T. cruzi. Nuestros hallazgos sugieren que la inducción de respuestas autoinmunes frente al ADN utilizado en la inmunización es poco probable

Propiedades antiprotozoarias de aceites esenciales extraídos de plantas cubanas / Antipreotozoan properties of essential oils extracted from Cuban plants

Se evaluó la actividad antiprotozoaria del aceite esencial extraído de Artemisia abrotanum, Chenopodium ambrosioides, Pinus caribaea, Piper aduncum y Piper auritum. Los aceites evaluados no mostraron actividad contra L. amazonensis; sin embargo, frente a Trichomonas vaginalis el aceite extraído de C. ambrosioides mostró una actividad promisoria con una concentración mínima inhibitoria de 25 mg/mL.

The antiprotozoan activity of the essential oil extracted from Artemisa abrotanum, Chenopodium ambrosioides, Pinus caribaea, Piper aduncum and Piper auritum, was evaluated. The evaluated oils did not show activity against L. amozonensis; however, the oil extracted from C. ambrosoides showed a promising activity against Trichomonas vaginalis with a minimum inhibitory concentration of 25 mg/mL.

Propiedades antiprotozoarias de aceites esenciales extraídos de plantas cubanas / Antipreotozoan properties of essential oils extracted from Cuban plants

Se evaluó la actividad antiprotozoaria del aceite esencial extraído de Artemisia abrotanum, Chenopodium ambrosioides, Pinus caribaea, Piper aduncum y Piper auritum. Los aceites evaluados no mostraron actividad contra L. amazonensis; sin embargo, frente a Trichomonas vaginalis el aceite extraído de C. ambrosioides mostró una actividad promisoria con una concentración mínima inhibitoria de 25 mg/mL(AU)

Inmunización con subgenoteca de Leishmania amazonensis protege contra el reto a ratones BALB/c / Immunization with Leishmania amazonensis subgenomic libraries protects BALB/c mice against the challenge

Se construyó una genoteca de Leishmania amazonensis en vector de expresión en células eucariotas (pEF1HisA, pEF1HisB, pEF1HisC). Se prepararon 2 subgenotecas con un número aproximado de 500 clones cada una y ratones BALB/c fueron inmunizados con 50 mg/0,1 mL de ADN de cada una; 2 inmunizaciones por vía IM, con 15 d de intervalo fueron realizadas. Grupos de ratones controles fueron inmunizados con ADN del plásmido vacío, con antígeno soluble del parásito (100 mg/0,1 mL) y solución salina fisiológica. Se midió el tamaño de las lesiones durante 12 semanas y al final del experimento, la carga parasitaria en los sitios de lesión fue determinada por el método de microtitulación en placas. Los ratones inmunizados con ADN 1, controlaron el tamaño de las lesiones, así como también los inmunizados con antígenos solubles, lo que alcanzó diferencia estadística (p< 0,05) en relación con el resto de los grupos, cuyas lesiones aumentaron de manera creciente. La carga de parásitos encontrada en los sitios de lesión corroboró los resultados anteriores, encontrando un número de promastigotes significativamente menor en aquellos que habían sido protegidos. Se concluyó que en la subgenoteca ADN1 deben existir genes, o fragmentos de genes, cuya expresión in vivo resulta protectora contra el reto, en el modelo murino empleado

Inmunización con subgenoteca de Leishmania amazonensis protege contra el reto a ratones BALB/c / Immunization with Leishmania amazonensis subgenomic libraries protects BALB/c mice against the challenge

Se construyó una genoteca de Leishmania amazonensis en vector de expresión en células eucariotas (pEF1HisA, pEF1HisB, pEF1HisC). Se prepararon 2 subgenotecas con un número aproximado de 500 clones cada una y ratones BALB/c fueron inmunizados con 50 mg/0,1 mL de ADN de cada una; 2 inmunizaciones por vía IM, con 15 d de intervalo fueron realizadas. Grupos de ratones controles fueron inmunizados con ADN del plásmido vacío, con antígeno soluble del parásito (100 mg/0,1 mL) y solución salina fisiológica. Se midió el tamaño de las lesiones durante 12 semanas y al final del experimento, la carga parasitaria en los sitios de lesión fue determinada por el método de microtitulación en placas. Los ratones inmunizados con ADN 1, controlaron el tamaño de las lesiones, así como también los inmunizados con antígenos solubles, lo que alcanzó diferencia estadística (p< 0,05) en relación con el resto de los grupos, cuyas lesiones aumentaron de manera creciente. La carga de parásitos encontrada en los sitios de lesión corroboró los resultados anteriores, encontrando un número de promastigotes significativamente menor en aquellos que habían sido protegidos. Se concluyó que en la subgenoteca ADN1 deben existir genes, o fragmentos de genes, cuya expresión in vivo resulta protectora contra el reto, en el modelo murino empleado(AU)

Evaluación de la respuesta inmune humoral por western blot en ratones inmunizados con una biblioteca genómica de expresión de Trypanosoma cruzi / Evaluation of the humoral immune response by Western Blot test in mice immunized with expression genomic library of Trypanosoma cruzi

Se construyó una biblioteca genómica de expresión de Trypanosoma cruzi con la utilización como vector el plásmido pcDNA3, con la cual se inmunizaron ratones de la línea isogénica BALB/c por vía intramuscular. Se empleó un grupo control positivo al que se le administraron antígenos solubles de T. cruzi y otro grupo que recibió el plásmido utilizado para la construcción de la biblioteca genómica; un grupo no recibió inmunización. A todos los animales se les extrajo sangre del plexo retrorbital 2 semanas posteriores a la tercera inmunización, para estudiar la respuesta de anticuerpos específicos contra los antígenos solubles del parásito mediante la técnica de western blot. Se obtuvo una respuesta de anticuerpos en los animales inmunizados con la biblioteca genómica de expresión y con antígenos solubles del parásito

Evaluación de la respuesta inmune humoral por western blot en ratones inmunizados con una biblioteca genómica de expresión de Trypanosoma cruzi / Evaluation of the answer immune humoral for western blot in mice immunized with a library genómica of expression of Trypanosoma cruzi

Se construyó una biblioteca genómica de expresión de Trypanosoma cruzi con la utilización como vector el plásmido pcDNA3, con la cual se inmunizaron ratones de la línea isogénica BALB/c por vía intramuscular. Se empleó un grupo control positivo al que se le administraron antígenos solubles de T. cruzi y otro grupo que recibió el plásmido utilizado para la construcción de la biblioteca genómica; un grupo no recibió inmunización. A todos los animales se les extrajo sangre del plexo retrorbital 2 semanas posteriores a la tercera inmunización, para estudiar la respuesta de anticuerpos específicos contra los antígenos solubles del parásito mediante la técnica de western blot. Se obtuvo una respuesta de anticuerpos en los animales inmunizados con la biblioteca genómica de expresión y con antígenos solubles del parásito(AU)

Plasmodium vinckei petteri: algunos aspectos de su esporogonia y esquizogonia exoeritrocitaria / Plasmodium vinckei petteri: some aspects of its sporogony and exoerythrocytic schizogony

Por medio de la infeccion experimental de Anopheles stephensi, a partir de ratones portadores de gametocitos de Plasmodium vinckei petteri, se realizo el estudio morfologico de la esporogonia, que compreende: la descripcion del ooquineto, la evolucion completa de los ooquistes y su transformacion final en esporozoitos. Estos fueron empleados mas tarde para infectar por via intravenosa nuevos ratones, a los que se realizo biopsias sucessivas, para el estudio de los esquizontes exoeritrociticos, cuya morfologia no difere de la de otras especies del grupo. Se determino la duracion minima del ciclo hepatico, que resulto ser de 61 horas. Estos datos, junto a otros que refieren las caracteristicas del ciclo hematico, ayudan a completar la informacion que se tiene sobre la especie, que la hacen recomendable para su utilizacion como modelo experimental en el estudio de la malaria humana.