Preliminary report: outbreak of Legionnaires disease in a hotel in Calp, Spain, update on 22 February 2012.

Research is ongoing on eighteen cases of Legionellosis, including four deaths, identified among tourists and employees in a hotel in Calp, Spain. Cases occurred during a period of two months, indicating the possibility of a point-source transmission at the hotel. An environmental investigation identified several positive samples in the hotel, which as a precautionary measure, was closed until requested improvements were made. Surveillance measures currently remain active.

Structural and functional characterization of a recombinant sticholysin I (rSt I) from the sea anemone Stichodactyla helianthus.

Sticholysins I and II (Sts I and II) are two potent cytolysins from the sea anemone Stichodactyla helianthus. These isoforms present 13 substitutions, with three non-conservative located at the N-terminus. St II is considerably more hemolytic than St I in human red blood cells, a result explained by the smaller number of negatively charged groups present at St II's N-terminus. In the present work, we have obtained a recombinant St I (rSt I), differing from the wild type in a single amino acid residue (E16Q). This pseudo-wild type is structurally similar to St I and shows a similar capacity to interact with and form pores in model membranes. This was assessed by the intrinsic fluorescence increase in the presence of liposomes, their adsorption to bilayers (measured by SPR), their concentration at the air-water interface, their interaction with lipid monolayers and their capacity to promote the release of carboxyfluorescein entrapped in liposomes. In spite of these similarities, rSt I presents a larger hemolytic activity in human red blood cells than St I, being intermediate in activity between Sts I and II. The results obtained in the present work emphasize that even the change of one single E by Q at the N-terminal segment may modify the toxin HA and show that this functional property is the most sensitive to subtle changes in the protein primary structure.

Caracterización de moléculas HLA tipo II y evaluación de citocinas en pacientes cubanos con artritis reumatoide

La Artritis Reumatoide es una enfermedad de etiología multifactorial, que involucra la presencia de factores genéticos, ambientales, inmunológicos y hormonales. En los últimos años se ha establecido una asociación entre la predisposición a padecer esta enfermedad y la existencia de determinados haplotipos del HLA clase II. El objetivo fundamental de este trabajo es la caracterización del polimorfismo de las moléculas HLA-DQB1 y HLA-DRB de un grupo de pacientes cubanos con Artritis Reumatoide, además analizar una posible correlación entre los niveles de varias citocinas proinflamatorias en un grupo de estos pacientes, con los alelos HLA tipo II genotipados, el sexo y el tiempo de diagnosticada la enfermedad. El estudio se llevo a cabo en 50 pacientes cubanos con el diagnóstico de Artritis Reumatoide y un grupo control, compuesto de 211 donantes sanos. Los haplotipos HLA-DQ y HLA-DRB1 fueron determinados a través de la reacción en cadena de la polimerasa. La cuantificación de las citocinas se realizó empleando inmuno-ensayos comerciales. Los resultados obtenidos en este análisis indican que los alelos con un radio de la razón de probabilidades superior a 2 fueron para el caso de la molécula HLA-DQB 1: HLA-DQB1*03 y *06, y para la molécula HLA-DRB 1 los alelos: *01, *04, *09 y *10. Encontramos además que los niveles de la citocina interferon ganma están significativamente aumentados en los pacientes con menos tiempo de diagnosticada la enfermedad. Este trabajo constituye el primer reporte de caracterización de las moléculas HLA tipo II, a través de técnicas moleculares, en pacientes cubanos con Artritis Reumatoide(AU)

Selective isolation and identification of N-terminal blocked peptides from tryptic protein digests.

A method for the easy isolation and direct sequencing of N-terminally blocked peptide in proteins refractory to N-terminal sequencing was developed. It is based essentially on tandem enzymatic treatments of the protein with trypsin and carboxypeptidase B, and selective isolation of the Nalpha-blocked peptide using ion-exchange chromatography. The chromatographic step was optimized for picomole amounts of sample and very short elution times by placing a thin layer of the resin over the membrane of an ultrafiltration tube. The isolated fraction can be analyzed directly using MALDI or ESI mass spectrometry. The method was applied to several recombinant and natural N-terminal acetylated proteins. A critical discussion on the intrinsic limitations of the method is also given.

Primary structure of two cytolysin isoforms from Stichodactyla helianthus differing in their hemolytic activity.

Sticholysin I (St-I) and sticholysin II (St-II) are cytolysins purified from the sea anemone Stichodactyla helianthus with a high degree of sequence identity (93%) but clearly differenced in their hemolytic activity. In order to go further into the structural determinants for the different behavior of St-I and St-II, we report here the complete amino acid sequences and the consensus secondary structure prediction of both proteins. The complete determination of St-II primary structure confirms the partial revision of cytolysin III amino acid sequence. All nonconservative changes between St-I and St-II are located at the N-terminal. According to our prediction these changes could be located at the same face of an alpha-helix during pore formation events and could account for the observed differences in hemolytic activity between St-I and St-II.

Purification and characterization of two hemolysins from Stichodactyla helianthus.

Two hemolysins, Sticholysin I (St I) and Sticholysin II (St II) were purified from the sea anemone Stichodactyla helianthus combining gel filtration and ion exchange chromatography. The amino acid composition of both cytolysins was determined revealing a high proportion of glycine, lysine, tyrosine and non-polar amino acids (alanine, leucine and valine). Cysteine was not found in either polypeptide. Molecular masses of St I and St II were 19401 and 19290 Da, respectively. N-terminal sequence analysis of St I and St II showed a high homology between them suggesting they are isoforms of the same cytolysin. Compared with other sea anemone cytolysins, St I and St II contain a 22 amino acid insertion fragment also present in Eq T II/Tn C and probably in CaT I and Hm T and absent in C III, the major hemolysin previously reported in this anemone.

Growth efficiency in transgenic tilapia (Oreochromis sp.) carrying a single copy of an homologous cDNA growth hormone.

Growth hormone (GH) has been shown to have a profound impact on fish physiology and metabolism. However, detailed studies in transgenic fish have not been conducted. We have characterized the food conversion efficiency, protein profile, and biochemical correlates of growth rate in transgenic tilapia expressing the tilapia GH cDNA under the control of human cytomegalovirus regulatory sequences. Transgenic tilapia exhibited about 3.6-fold less food consumption than nontransgenic controls (P < 0.001). The food conversion efficiency was significantly (P < 0.05) higher (290%) in transgenic tilapia (2.3 +/- 0.4) than in the control group (0.8 +/- 0.2). Efficiency of growth, synthesis retention, anabolic stimulation, and average protein synthesis were higher in transgenic than in nontransgenic tilapia. Distinctive metabolic differences were found in transgenic juvenile tilapia. We had found differences in hepatic glucose, and in agreement with previous results we observed differences in the level of enzymatic activities in target organs. We conclude that GH-transgenic juvenile tilapia show altered physiological and metabolic conditions and are biologically more efficient.

Kinetics and mechanism of St I modification by peroxyl radicals.

St I is a toxin present in the Caribbean Sea anemone Stichodactyla helianthus which is highly hemolytic in the nanomolar concentration range. Exposure of the toxin to free radicals produced in the pyrolysis of 2,2'-azobis(2-amidinopropane) hydrochloride leads to a progressive loss of hemolytic activity. This loss of hemolytic activity is accompanied by extensive modification of tryptophan residues. On the average, three tryptophan residues are modified by each inactivated toxin. The loss of hemolytic activity of St I takes place without significant changes in the protein structure, as evidenced by the similarity of the fluorescence and CD spectra of native and modified proteins. Also, the native and modified ensembles present a similar resistance to their denaturation by guanidinium chloride. The hemolytic behavior and the performance of the toxin at the single-channel level when incorporated to black lipid membranes suggest that the modified ensemble can be considered as composed of inactive toxins and active toxins whose behavior is similar to that of the native proteins. These results, together with the lack of induction time in the activity loss, suggest that the fall of hemolytic activity takes place by an all-or-nothing inactivation mechanism in which the molecules become inactive when a critical amino acid residue is modified.

Modification of sticholysin II hemolytic activity by free radicals.

Sticholysin II is a highly hemolytic toxin present in the caribbean sea anemone Stichodactyla helianthus. Pre-incubation of St II with 2,2'-azobis(2-amidinopropane), a source of peroxyl radicals in air saturated solution, readily reduces its hemolytic activity. Analysis of the amino acids present in the protein after its modification shows that only tryptophan groups are significantly modified by the free radicals. According to this, the loss of hemolytic activity correlates with the loss of the protein intrinsic fluorescence. The results indicate that, at high toxin concentrations, nearly a tryptophan residue and 0.2 toxin molecules are inactivated by each radical introduced into the system. Association of St II to multilamellar liposomes (egg yolk phosphatidyl choline:sphingomyelin 1:1) increases the toxin intrinsic fluorescence, indicating a more hydrophobic average environment of the five tryptophan groups of the protein. In agreement with this, incorporation of St II to the liposomes reduces the rate of fluorescence loss during its modification by free radicals, particularly at long incubation times. These results are explained in terms of two populations of tryptophans that are quenched at different rates by acrylamide and whose rates of inactivation by free radicals are also different.

Expression in Escherichia coli of the lpdA gene, protein sequence analysis and immunological characterization of the P64k protein from Neisseria meningitidis.

By making use of recombinant DNA technology it is possible to characterize meningococcal outer membrane proteins (OMPs) capable of stimulating a host immune response. The lpdA gene, which codes for an OMP (P64k) from Neisseria meningitidis, was cloned in Escherichia coli. The recombinant protein was recognized by sera from patients convalescing from meningococcal disease. The monoclonal antibodies obtained against the recombinant protein recognized the natural protein on a Western blot, and monoclonal antibody 114 was assayed in ELISA with a panel of 85 N. meningitidis strains. The protein was recognized in 81 strains (95.3%); the strains that were not recognized were neither epidemic nor isolated from systemic disease. The complete amino acid sequence of P64k was obtained by automatic sequencing and MS.

Purification, characterization and immobilization of proteinase inhibitors from Stichodactyla helianthus.

Isolation of proteinase inhibitors from the sea anemone Stichodactyla helianthus was achieved by trichloroacetic acid treatment of the aqueous extract followed by affinity chromatography on trypsin-Sepharose and ion-exchange chromatography on CM-cellulose. The average molecular mass of the major inhibitor (ShPI-I) obtained by fast atom bombardment mass spectrometry (FAB-MS) was 6110.6 Da. The amino acid sequence was determined by FAB-MS combined with manual Edman degradation, digestions with endopeptidases and exopeptidases and automatic sequencing. The sequence of ShPI-I (55 amino acids) was compared with those reported in the SwissProt database for several proteinase inhibitors and significant similarity to inhibitors belonging to the Kunitz family was observed. ShPI-I exhibits a broad specificity for serine, cysteine and aspartic proteinases. The dissociation constants of the complexes formed with different enzymes were determined. The affinity-purified fraction (PI) was immobilized on Sepharose and used in the purification of different classes of proteinases.

Purificación y caracterización parcial de una enzima dextranasa a partir de una cepa del hongo del género Penicillium / Purification and partial characterization of a destranase enzyme from a fungal strain of the genero Penicillium

Una fracción dextranasa (EC 3.2.1.11) excretada por un hongo del género Penicillium, fue purificada después de cinco días de inducción de la enzima en cultivo sumergido en agitación a 28-C. El crudo enzimático fue precipitado con 80 % de sulfato de amonio, resuspendido en tampóm acetato y aplicado en cromatografía sucesivas de filtración por el gel e intercambio iónico. La fracción homogénea de dextrabasa está formada por dos bandas de proteinas superpuestas con un peso molecular aproximado de 67 000 Da, un nivel de glicosidación entre 15-18 % y un punto isoeléctrico a pH 3,88. La actividad específica osciló entre 1 500 y 2 000 U/mg de proteína con un máximo de actividad a pH 5

Purificación y caracterización parcial de una enzima dextranasa a partir de una cepa del hongo del género Penicillium / Purification and partial characterization of a destranase enzyme from a fungal strain of the genero Penicillium

Una fracción dextranasa (EC 3.2.1.11) excretada por un hongo del género Penicillium, fue purificada después de cinco días de inducción de la enzima en cultivo sumergido en agitación a 28-C. El crudo enzimático fue precipitado con 80

de sulfato de amonio, resuspendido en tampóm acetato y aplicado en cromatografía sucesivas de filtración por el gel e intercambio iónico. La fracción homogénea de dextrabasa está formada por dos bandas de proteinas superpuestas con un peso molecular aproximado de 67 000 Da, un nivel de glicosidación entre 15-18

y un punto isoeléctrico a pH 3,88. La actividad específica osciló entre 1 500 y 2 000 U/mg de proteína con un máximo de actividad a pH 5 (AU)

Caracterización de la estructura primaria de la interleucina-2 humana recombinante / Characterization of the primary structure of the recombinant human interleukin-2

La interleucina-2 humana recombinante clonada y expresada en E. coli, y purificada mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), fue analizada para verificar su estructura primaria. El análisis de aminoácidos de la proteína pura coincide con la composición teórica esperada. La proteína fue hidrolizada con bromuro de cianógeno, los péptidos separados por HPLC fueron secuenciados automáticamente y determinada su composición aminoacídica, confirmándose la estructura desde el extremo N-terminal hasta el residuo 56. Con el propósito de completar la secuencia de la proteína, esta fue reducida y carboximetilada. La proteína se sometió a digestión con endoproteinasa GLU-C (Staphyloccocus aureus V8) y una parte de esta digestión se incubó a continuación con tripsina. Los péptidos purificados mediante gel filtración (Biogel P-6) y HPLC en fase inversa, fueron secuenciados con la técnica manual de doble acoplamiento con dimetilaminoazobenzeno isotiocianato e isotiocianato de fenilo (DABITC/PITC). La purificación de la digestión tríptica de la proteína reducida y carboximetilada mediante fase inversa, suministró los péptidos para análisis en espectrometría de masas utilizando como fuente de ionización bombardeo con átomos rápidos (MS FAB). Tanto los resultados de la secuenciación como la espectrometría de masas confirman que la interleucina-2 obtenida en E. coli posee la estructura primaria reportada para esta proteína

Caracterización de la estructura primaria de la interleucina-2 humana recombinante / Characterization of the primary structure of the recombinant human interleukin-2

La interleucina-2 humana recombinante clonada y expresada en E. coli, y purificada mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), fue analizada para verificar su estructura primaria. El análisis de aminoácidos de la proteína pura coincide con la composición teórica esperada. La proteína fue hidrolizada con bromuro de cianógeno, los péptidos separados por HPLC fueron secuenciados automáticamente y determinada su composición aminoacídica, confirmándose la estructura desde el extremo N-terminal hasta el residuo 56. Con el propósito de completar la secuencia de la proteína, esta fue reducida y carboximetilada. La proteína se sometió a digestión con endoproteinasa GLU-C (Staphyloccocus aureus V8) y una parte de esta digestión se incubó a continuación con tripsina. Los péptidos purificados mediante gel filtración (Biogel P-6) y HPLC en fase inversa, fueron secuenciados con la técnica manual de doble acoplamiento con dimetilaminoazobenzeno isotiocianato e isotiocianato de fenilo (DABITC/PITC). La purificación de la digestión tríptica de la proteína reducida y carboximetilada mediante fase inversa, suministró los péptidos para análisis en espectrometría de masas utilizando como fuente de ionización bombardeo con átomos rápidos (MS FAB). Tanto los resultados de la secuenciación como la espectrometría de masas confirman que la interleucina-2 obtenida en E. coli posee la estructura primaria reportada para esta proteína (AU)

Caracterización química del interferón humano alfa-2 recombinante / Chemical characterization of human alpha-2 recombinant interferon

El interferón humano alfa-2 recombinante con alto grado de pureza, expresado en E. coli, fue analizado con vistas a verificar su secuencia aminoacídico. El análisis de aminoácidos permitió comprobar que el contenido aminoacídico de la molécula es correcto. Mediante estudios de cromatografía líquida de alta eficacia se evaluó la pureza de la proteína. Se obtuvieron los mapas peptídicos con diferentes proteasas y métodos químicos, aislándose de una de estas digestiones los péptidos trípticos para su secuencia automática. Se determinó que una parte del material se inicia en metionina y otra en cisteína. La secuencia aminoacídica de la proteína se verificó, coincidiendo esta con la secuencia predicha a partir de la secuencia del gen clonado. Se estableció la secuencia C-terminal mediante análisis enzimático

Caracterización química del interferón humano alfa-2 recombinante / Chemical characterization of human alpha-2 recombinant interferon

El interferón humano alfa-2 recombinante con alto grado de pureza, expresado en E. coli, fue analizado con vistas a verificar su secuencia aminoacídico. El análisis de aminoácidos permitió comprobar que el contenido aminoacídico de la molécula es correcto. Mediante estudios de cromatografía líquida de alta eficacia se evaluó la pureza de la proteína. Se obtuvieron los mapas peptídicos con diferentes proteasas y métodos químicos, aislándose de una de estas digestiones los péptidos trípticos para su secuencia automática. Se determinó que una parte del material se inicia en metionina y otra en cisteína. La secuencia aminoacídica de la proteína se verificó, coincidiendo esta con la secuencia predicha a partir de la secuencia del gen clonado. Se estableció la secuencia C-terminal mediante análisis enzimático

Grandes mononucleares tipo linfoblasto en el líquido sinovial de las artropatías inflamatorias crónicas / Sinovial lymphoblast-like large mononuclear cells in chronic inflammatory arthropaties

El estudio del líquido sinovial mediante microscopía óptica y electrónica, mostró la existencia de grandes células mononucleares tipo linfoblasto en pacientes con artritis reumatoide (81.2%), artritis reumatoide juvenil (75%) y espondiloartropatías seronegativas (60%). Las características morfológicas de estas células en la microscopía óptica fueron: tamaño aproximado 20 micras, índice núcleo citoplasma 2:1, citoplasma basófilo, patrón leptocromático del núcleo y 2 ó 3 nucleolos. El análisis de estas células por microscopía electrónica demostró una forma redondeada o ligeramente oval, un núcleo usualmente redondeado que puede presentar invaginaciones, heterocromatina dispuesta en un fino anillo cerca de la membrana nuclear, citoplasma ocupado por mono y polirribosomas y ausencia de aparato de Golgi. La identificación de las grandes células mononucleares tipo linfoblasto en el líquido sinovial puede ser dato de importancia diagnóstica de las artropatías inflamatorias crónicas, con probables fenómenos antoinmunes, como la artritis reumatoide y las espondiloartropatías seronegativas