RESUMO
Hedgehog (Hh) proteins function in cell/cell signaling processes linked to human embryo development and the progression of several types of cancer. Here, we describe an optical assay of hedgehog cholesterolysis, a unique autoprocessing event critical for Hh function. The assay uses a recombinant Förster resonance energy transfer (FRET)-active Hh precursor whose cholesterolysis can be monitored continuously in multi-well plates (dynamic range=4, Z'=0.7), offering advantages in throughput over conventional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) assays. Application of the optical assay in a pilot small molecule screen produced a novel cholesterolysis inhibitor (apparent IC50=5×10(-6)M) that appears to inactivate hedgehog covalently by a substitution nucleophilic aromatic (SNAr) mechanism.
Assuntos
Antineoplásicos/farmacologia , Colesterol/metabolismo , Proteínas de Drosophila/antagonistas & inibidores , Proteínas Hedgehog/antagonistas & inibidores , Ensaios de Triagem em Larga Escala , Processamento de Proteína Pós-Traducional/efeitos dos fármacos , Motivos de Aminoácidos , Animais , Sequência Conservada , Proteínas de Drosophila/química , Proteínas de Drosophila/genética , Proteínas de Drosophila/metabolismo , Drosophila melanogaster/metabolismo , Transferência Ressonante de Energia de Fluorescência , Proteínas Hedgehog/química , Proteínas Hedgehog/genética , Proteínas Hedgehog/metabolismo , Cinética , Proteínas Luminescentes/química , Proteínas Luminescentes/genética , Proteínas Luminescentes/metabolismo , Nitrobenzoatos/farmacologia , Fragmentos de Peptídeos/antagonistas & inibidores , Fragmentos de Peptídeos/química , Fragmentos de Peptídeos/genética , Fragmentos de Peptídeos/metabolismo , Projetos Piloto , Mutação Puntual , Domínios e Motivos de Interação entre Proteínas , Precursores de Proteínas/antagonistas & inibidores , Precursores de Proteínas/química , Precursores de Proteínas/genética , Precursores de Proteínas/metabolismo , Proteólise/efeitos dos fármacos , Proteínas Recombinantes de Fusão/química , Proteínas Recombinantes de Fusão/metabolismo , Bibliotecas de Moléculas Pequenas , Tetrazóis/farmacologiaRESUMO
Hedgehog proteins, signaling molecules implicated in human embryo development and cancer, can be inhibited at the stage of autoprocessing by the trivalent arsenical phenyl arsine oxide (PhAs(III) ). The interaction (apparent Ki , 4 × 10(-7) M) is characterized by an optical binding assay and by NMR spectroscopy. PhAs(III) appears to be the first validated inhibitor of hedgehog autoprocessing, which is unique to hedgehog proteins and essential for biological activity.
Assuntos
Arsenicais/química , Colesterol/química , Proteínas Hedgehog/antagonistas & inibidores , Precursores de Proteínas/antagonistas & inibidores , Proteínas Recombinantes de Fusão/química , Animais , Domínio Catalítico , Relação Dose-Resposta a Droga , Drosophila melanogaster/química , Drosophila melanogaster/metabolismo , Expressão Gênica , Proteínas Hedgehog/química , Proteínas Hedgehog/genética , Proteínas Hedgehog/metabolismo , Humanos , Hidrólise , Cinética , Modelos Moleculares , Ligação Proteica , Precursores de Proteínas/química , Precursores de Proteínas/genética , Precursores de Proteínas/metabolismo , Proteínas Recombinantes de Fusão/genética , Proteínas Recombinantes de Fusão/metabolismoRESUMO
A series of tolyl 2-azido-2-deoxy-thio-glucoside donors with different combinations of protecting groups were prepared. These donors were used in glycosylation reactions to test the correlations between the stereoselectivity and the pattern of the protecting groups. Acetyl groups showed a position dependent stereo-directing effect. A remote participating mechanism is proposed to explain the observed results.
