ß-micrustoxin (Mlx-9), a PLA2 from Micrurus lemniscatus snake venom: biochemical characterization and anti-proliferative effect mediated by p53.

Background: Endogenous phospholipases A2 (PLA2) play a fundamental role in inflammation, neurodegenerative diseases, apoptosis and cellular senescence. Neurotoxins with PLA2 activity are found in snake venoms from the Elapidae and Viperidae families. The mechanism of action of these neurotoxins have been studied using hippocampal and cerebellar neuronal cultures showing [Ca2+]i increase, mitochondrial depolarization and cell death. Astrocytes are rarely used as a model, despite being modulators at the synapses and responsible for homeostasis and defense in the central nervous system. Preserving the cell division ability, they can be utilized to study the cell proliferation process. In the present work cultured astrocytes and glioblastoma cells were employed to characterize the action of ß-micrustoxin (previously named Mlx-9), a PLA2 isolated from Micrurus lemniscatus snake venom. The ß-micrustoxin structure was determined and the cell proliferation, cell cycle phases and the regulatory proteins p53, p21 and p27 were investigated. Methods: ß-micrustoxin was characterized biochemically by a proteomic approach. Astrocytes were obtained by dissociation of pineal glands from Wistar rats; glioblastoma tumor cells were purchased from ATCC and Sigma and cultured in DMEM medium. Cell viability was evaluated by MTT assay; cell proliferation and cell cycle phases were analyzed by flow cytometry; p53, p21 and p27 proteins were studied by western blotting and immunocytochemistry. Results: Proteomic analysis revealed fragments on ß-micrustoxin that aligned with a PLA2 from Micrurus lemniscatus lemniscatus previously identified as transcript ID DN112835_C3_g9_i1/m.9019. ß-micrustoxin impaired the viability of astrocytes and glioblastoma tumor cells. There was a reduction in cell proliferation, an increase in G2/M phase and activation of p53, p21 and p27 proteins in astrocytes. Conclusion: These findings indicate that ß-micrustoxin from Micrurus lemniscatus venom could inhibit cell proliferation through p53, p21 and p27 activation thus imposing cell cycle arrest at the checkpoint G2/M.

Intrahippocampal injection of TsTX-I increases the levels of INF-γ in the cerebral tissue but not the levels of glutamate.

TsTX-I, isolated from Tityus serrulatus scorpion venom, causes epileptic-like discharges when injected into the central nervous system. The involvement of excitatory amino acids and cytokines in this activity was investigated. Our results have demonstrated that TsTX-I increases the release of IFN-γ but does not alter the intracerebral concentration of the excitatory amino acids in rats. Thus, this cytokine seems to be more important in the convulsive process than glutamate.

Determinação de brodifacoum em formulações de iscas raticidas por cromatografia em camada delgada de alta eficiência

O brodifacoum é um composto hidroxicumarínico de 2º geração utilizado como ativo em formulações raticidas, tais como, iscas e blocos parafinados. Tem seu uso regulamentado pelo Ministério da Saúde (RDC º326 de 09 de novembro de 2005). O brodifacoum, e outros compostos hidroxicumarínicos derivados da warfarina, tem ação anticoagulante por interferirem no metabolismo davitamina K afetando os fatores de coagulação do sangue que são dependentes desta vitamina. Para a determinação da concentração de brodifacoum em iscas raticida utilizou-se a técnica de cromatografia em camada delgada de alta eficiência (CCDAE). O sistema utilizado para as determinações consiste no amostrador automático CAMAG modelo TLC Sampler 4, equipado com microsseringa de 25 uL e densitômetro Camag modelo TLC Scaner 3, sendo ambos controlados pelo software Wincat 4. Utilizou-se placa de vidro na medida de 10x20 cm de fase normal com indicador de fluorescência da marca Macherey-Nagel e todos os solventes utilizados foram de grau HPLC ou resíduo de pesticida. A mistura de solvente utilizada como fase móvel foi n-hexano – acetato de etila (4:1) em cuba de vidro vertical e bipartida, com desenvolvimento unidimensional ascendente, à temperatura ambiente. Para a extração do brodifacoum foram estudadas as seguintes misturas de solventes: diclorometano:ácido fórmico 50+1, Clorofórmio:acetona (1:1), lorofórmio:metanol (9:1). Sendo as misturas de diclorometano:ácido fórmico 50+1 e Clorofórmio:metanol (9:1) as que apresentaram melhor desempenho. O limite de detecção do método foi igual a 1,78 ug por grama de isca, e o limite de quantificação é de 5,93 ug por grama de isca.

Determinação de brodifacoum em formulações de iscas raticidas por cromatografia em camada delgada de alta eficiência / Brodifacoum determination in baits raticide formulations by high performance thin layer chromatography

O brodifacoum é um composto hidroxicumarínico de 2º geração utilizado como ativo em formulações raticidas, tais como, iscas e blocos parafinados. Tem seu uso regulamentado pelo Ministério da Saúde (RDC º326 de 09 de novembro de 2005). O brodifacoum, e outros compostos hidroxicumarínicos derivados da warfarina, tem ação anticoagulante por interferirem no metabolismo davitamina K afetando os fatores de coagulação do sangue que são dependentes desta vitamina. Para a determinação da concentração de brodifacoum em iscas raticida utilizou-se a técnica de cromatografia em camada delgada de alta eficiência (CCDAE). O sistema utilizado para as determinações consiste no amostrador automático CAMAG modelo TLC Sampler 4, equipado com microsseringa de 25 uL e densitômetro Camag modelo TLC Scaner 3, sendo ambos controlados pelo software Wincat 4. Utilizou-se placa de vidro na medida de 10x20 cm de fase normal com indicador de fluorescência da marca Macherey-Nagel e todos os solventes utilizados foram de grau HPLC ou resíduo de pesticida. A mistura de solvente utilizada como fase móvel foi n-hexano – acetato de etila (4:1) em cuba de vidro vertical e bipartida, com desenvolvimento unidimensional ascendente, à temperatura ambiente. Para a extração do brodifacoum foram estudadas as seguintes misturas de solventes: diclorometano:ácido fórmico 50+1, Clorofórmio:acetona (1:1), lorofórmio:metanol (9:1). Sendo as misturas de diclorometano:ácido fórmico 50+1 e Clorofórmio:metanol (9:1) as que apresentaram melhor desempenho. O limite de detecção do método foi igual a 1,78 ug por grama de isca, e o limite de quantificação é de 5,93 ug por grama de isca.