ZIKV - CDB: A Collaborative Database to Guide Research Linking SncRNAs and ZIKA Virus Disease Symptoms.

BACKGROUND: In early 2015, a ZIKA Virus (ZIKV) infection outbreak was recognized in northeast Brazil, where concerns over its possible links with infant microcephaly have been discussed. Providing a causal link between ZIKV infection and birth defects is still a challenge. MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs (sncRNAs) that regulate post-transcriptional gene expression by translational repression, and play important roles in viral pathogenesis and brain development. The potential for flavivirus-mediated miRNA signalling dysfunction in brain-tissue development provides a compelling hypothesis to test the perceived link between ZIKV and microcephaly. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Here, we applied in silico analyses to provide novel insights to understand how Congenital ZIKA Syndrome symptoms may be related to an imbalance in miRNAs function. Moreover, following World Health Organization (WHO) recommendations, we have assembled a database to help target investigations of the possible relationship between ZIKV symptoms and miRNA-mediated human gene expression. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: We have computationally predicted both miRNAs encoded by ZIKV able to target genes in the human genome and cellular (human) miRNAs capable of interacting with ZIKV genomes. Our results represent a step forward in the ZIKV studies, providing new insights to support research in this field and identify potential targets for therapy.

Development and validation of PCR-based assays for diagnosis of American cutaneous leishmaniasis and identification of the parasite species.

In this study, PCR assays targeting different Leishmania heat-shock protein 70 gene (hsp70) regions, producing fragments ranging in size from 230-390 bp were developed and evaluated to determine their potential as a tool for the specific molecular diagnosis of cutaneous leishmaniasis (CL). A total of 70 Leishmania strains were analysed, including seven reference strains (RS) and 63 previously typed strains. Analysis of the RS indicated a specific region of 234 bp in the hsp70 gene as a valid target that was highly sensitive for detection of Leishmania species DNA with capacity of distinguishing all analyzed species, after polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). This PCR assay was compared with other PCR targets used for the molecular diagnosis of leishmaniasis: hsp70 (1400-bp region), internal transcribed spacer (ITS)1 and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6pd). A good agreement among the methods was observed concerning the Leishmania species identification. Moreover, to evaluate the potential for molecular diagnosis, we compared the PCR targets hsp70-234 bp, ITS1, G6pd and mkDNA using a panel of 99 DNA samples from tissue fragments collected from patients with confirmed CL. Both PCR-hsp70-234 bp and PCR-ITS1 detected Leishmania DNA in more than 70% of the samples. However, using hsp70-234 bp PCR-RFLP, identification of all of the Leishmania species associated with CL in Brazil can be achieved employing a simpler and cheaper electrophoresis protocol.

Development and validation of PCR-based assays for diagnosis of American cutaneous leishmaniasis and identificatio nof the parasite species

In this study, PCR assays targeting different Leishmania heat-shock protein 70 gene (hsp70) regions, producing fragments ranging in size from 230-390 bp were developed and evaluated to determine their potential as a tool for the specific molecular diagnosis of cutaneous leishmaniasis (CL). A total of 70 Leishmania strains were analysed, including seven reference strains (RS) and 63 previously typed strains. Analysis of the RS indicated a specific region of 234 bp in the hsp70 gene as a valid target that was highly sensitive for detection of Leishmania species DNA with capacity of distinguishing all analyzed species, after polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorfism (PCR-RFLP). This PCR assay was compared with other PCR targets used for the molecular diagnosis of leishmaniasis: hsp70 (1400-bp region), internal transcribed spacer (ITS)1 and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6pd). A good agreement among the methods was observed concerning the Leishmania species identification. Moreover, to evaluate the potential for molecular diagnosis, we compared the PCR targets hsp70-234 bp, ITS1, G6pd and mkDNA using a panel of 99 DNA samples from tissue fragments collected from patients with confirmed CL. Both PCR-hsp70-234 bp and PCR-ITS1 detected Leishmania DNA in more than 70% of the samples. However, using hsp70-234 bp PCR-RFLP, identification of all of the Leishmania species associated with CL in Brazil can be achieved employing a simpler and cheaper electrophoresis protocol.

Species diversity causing human cutaneous leishmaniasis in Rio Branco, state of Acre, Brazil.

OBJECTIVE: Information on Leishmania species diversity in western Brazilian Amazon and the clinical picture of human cutaneous leishmaniasis it causes is scarce. We describe clinical findings, diagnostic procedures and identification of Leishmania species in patients from that region. METHODS: The sample consisted of 50 patients, prospectively evaluated for epidemiological and clinical characteristics by means of a structured questionnaire. Conventional and molecular tools were applied to confirm the parasitological diagnosis and identify the species responsible for the disease. RESULTS: Patients were predominantly male (76.5%) and living in rural areas. Median average age was 18 years and median average disease evolution was 8 weeks. For the diagnostic procedures of leishmanin skin test, direct visualization of amastigotes in dermal scrapings and parasite culture of aspirates of the ulcer border were positive for 98%, 52% and 34%, respectively. Molecular methods applied to DNA extracted from skin biopsies of the 50 patients yielded 100%, 82% and 44% positivity by PCR minicircle kDNA, PCR-RFLP ITS1rDNA and PCR-glucose-6-phosphate (G6P), respectively. Fourteen samples from 13 patients were successfully isolated and identified. Multilocus enzyme electrophoresis, PCR-RFLP ITS1rDNA and PCR-G6P permitted identification of the Leishmania species responsible for the aetiology of American tegumentary leishmaniasis in 60% of the examined patients: 16 Leishmania (Viannia) braziliensis, 12 Leishmania (Viannia) lainsoni, 1 Leishmania (Viannia) guyanensis and 1 putative hybrid of Leishmania (Viannia) naiffi and L. (V.) lainsoni. CONCLUSION: The clinical and epidemiological behaviour of cutaneous leishmaniasis in Acre, Brazil, is similar to other Amazon scenarios previously described; however Acre's complex parasite diversity may be contributed to the concomitant circulation of at least three distinct Leishmania species. The implementation of control interventions in the studied area must take into consideration the possibility of various expected phlebotomine vectors and reservoirs.

Use of PCR-RFLP to identify Leishmania species in naturally-infected dogs.

Tissue imprints on Giemsa stained slides from dogs were used to investigate the presence of Leishmania amastigotes by either optical microscopy (OM) or Polymerase chain reaction (PCR) detection of DNA. Samples from skin, spleen, lymph node, liver and bone marrow from a Leishmaniasis endemic area dogs where Leishmania (Leishmania) chagasi and Leishmania (Viannia) braziliensis are sympatric were studied. Dogs were initially diagnosed by Indirect Immunofluorescence (IIF), as which 39 were IIF positive (> or = 1:40) and 16 negative. The IIF positive dogs were clinically grouped as symptomatic (n = 15), oligosymptomatic (n = 12) and asymptomatic (n = 12). Although PCR positivity was higher in symptomatic dogs, specially their skin samples, there was no significant difference among clinical groups or organs examined. Ten (62.5%) out of 16 IIF and OM negative animals were positive for PCR in at least one organ. Forty-eight positive PCR amplicons were further submitted to RFLP for Leishmania identification. All dogs were infected with L. (L.) chagasi except one, infected with L. (V.) braziliensis. PCR was more efficient than IIF and OM to diagnose canine visceral Leishmaniasis (CVL), regardless of the organ examined and the clinical form present. The use of PCR together with serology helps determining the extension of sub clinical infection in CVL endemic areas and provides a better estimate of the number of dogs to be targeted for control measures. In conclusion, our data reinforce the need for a specific diagnosis of canine infection in areas where diverse Leishmania species are sympatric and demonstrate that PCR-RFLP can be used to identify Leishmania species in dog tissue imprint stained slides.

PCR-RFLP mkDNA no diagnóstico e identificação das espécies de Leishmania causadoras de Leishmaniose cutânea no Brasil

Neste trabalho estudamos a aplicabilidade e a capacidade da PCR-RFLP mkDNA na identificação e diferenciação de espécies de Leishmania que circulam no Brasil. Esta técnica diferencia-se das outras PCRs seguidas de restrição no produto de amplificação, por utilizar como alvo a região conservada dos minicírculos de kDNA das leishmânias. Inicialmente, testamos a técnica num conjunto de amostras que haviam sido previamente caracterizadas por hibridização com sondas radioativas, de uma região endêmica para Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) onde apenas L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis haviam sido encontradas. A comparação dos resultados obtidos com a PCR-RFLP mkDNA e hibridização foram 91,5 porcento concordantes, mostrando que a técnica apresentava potencial para ser usada diretamente em material clínico

Em seguida, testamos a capacidade da PCR-RFLP mkDNA em diferenciar, também, as espécies L. (V.) guyanensis, L. (V.) shawi, L. (V.) naiffi, L. (V.) lainsoni e L. (L.) chagasi, todas presentes no Brasil. Para isto, fizemos um mapa de restrição nas seqüências de DNA da região conservada dos minicírculos de Leishmania depositadas no GenBank e testamos a PCR-RFLP mkDNA em cepas referência destas espécies e em 23 isolados de Leishmania de diferentes zimodemas, que confirmaram a identidade dos parasitos. Propomos um esquema de diferenciação que contempla a maioria das espécies de Leishmania presentes no Brasil, entretanto, não conseguimos diferenciar L. (V.) braziliensis de L. (V.) guyanensis. A partir destes resultados partimos para a aplicação da metodologia em dois conjuntos de amostras clínicas.No primeiro conjunto, testamos a PCR-RFLP mkDNA na identificação de Leishmania em amostras da região endêmica para LTA do Vale do Rio Doce - MG. Os parasitos foram extraídos de uma amostra de 475 lâminas coradas pelo Giemsa, arquivadas entre 1965-2000. A PCR-RFLP mkDNA foi positiva em 395 (83,2 porcento) laminas e L. (V.) braziliensis a única espécie presente na amostra. No segundo conjunto, avaliamos o uso da PCR-RFLP mkDNA na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA de diferentes áreas endêmicas do Brasil em amostras clínicas de 329 pacientes, de 6 estados do Brasil, preservadas de diversas formas. Independente da forma de preservação, a PCR-RFLP mkDNA detectou e identificou L. (V.) braziliensis (89,0 porcento), L. (L.) amazonensis (6,4 porcento) e L. (V.) lainsoni (4,6 porcento) nas amostras clínicas. Por ser uma técnica muito sensível, de rápida execução, de fácil leitura, confirmar as caracterizações dos parasitos feitas previamente por outros métodos, sugerimos a utilização da PCR-RFLP mkDNA como um método alternativo na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA no Brasil

PCR-RFLP mkDNA no diagnóstico e identificação das espécies de Leishmania causadoras de Leishmaniose cutânea no Brasil / PCR-RFLP mkDNA in the diagnosis and identification of Leishmania species causing cutaneous leishmaniasis in Brazil

Neste trabalho estudamos a aplicabilidade e a capacidade da PCR-RFLP mkDNA na identificação e diferenciação de espécies de Leishmania que circulam no Brasil. Esta técnica diferencia-se das outras PCRs seguidas de restrição no produto de amplificação, por utilizar como alvo a região conservada dos minicírculos de kDNA das leishmânias. Inicialmente, testamos a técnica num conjunto de amostras que haviam sido previamente caracterizadas por hibridização com sondas radioativas, de uma região endêmica para Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) onde apenas L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis haviam sido encontradas. A comparação dos resultados obtidos com a PCR-RFLP mkDNA e hibridização foram 91,5 por cento concordantes, mostrando que a técnica apresentava potencial para ser usada diretamente em material clínico. Em seguida, testamos a capacidade da PCR-RFLP mkDNA em diferenciar, também, as espécies L. (V.) guyanensis, L. (V.) shawi, L. (V.) naiffi, L. (V.) lainsoni e L. (L.) chagasi, todas presentes no Brasil. Para isto, fizemos um mapa de restrição nas seqüências de DNA da região conservada dos minicírculos de Leishmania depositadas no GenBank e testamos a PCR-RFLP mkDNA em cepas referência destas espécies e em 23 isolados de Leishmania de diferentes zimodemas, que confirmaram a identidade dos parasitos. Propomos um esquema de diferenciação que contempla a maioria das espécies de Leishmania presentes no Brasil, entretanto, não conseguimos diferenciar L. (V.) braziliensis de L. (V.) guyanensis. A partir destes resultados partimos para a aplicação da metodologia em dois conjuntos de amostras clínicas. No primeiro conjunto, testamos a PCR-RFLP mkDNA na identificação de Leishmania em amostras da região endêmica para LTA do Vale do Rio Doce - MG. Os parasitos foram extraídos de uma amostra de 475 lâminas coradas pelo Giemsa, arquivadas entre 1965-2000. A PCR-RFLP mkDNA foi positiva em 395 (83,2 porcento) laminas e L. (V.) braziliensis a única espécie presente na amostra. No segundo conjunto, avaliamos o uso da PCR-RFLP mkDNA na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA de diferentes áreas endêmicas do Brasil em amostras clínicas de 329 pacientes, de 6 estados do Brasil, preservadas de diversas formas. Independente da forma de preservação, a PCR-RFLP mkDNA detectou e identificou L. (V.) braziliensis (89,0 por cento), L. (L.) amazonensis (6,4 por cento) e L. (V.) lainsoni (4,6 por cento) nas amostras clínicas. Por ser uma técnica muito sensível, de rápida execução, de fácil leitura, confirmar as caracterizações dos parasitos feitas previamente por outros métodos, sugerimos a utilização da PCR-RFLP mkDNA como um método alternativo na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA no Brasil.

PCR-RFLP mkDNA no diagnóstico e identificação das espécies de Leishmania causadoras de Leishmaniose cutânea no Brasil / PCR-RFLP mkDNA in the diagnosis and identification of causing species of Leishmania of Leishmaniasis cutaneous in Brazil

Neste trabalho estudamos a aplicabilidade e a capacidade da PCR-RFLP mkDNA na identificação e diferenciação de espécies de Leishmania que circulam no Brasil. Esta técnica diferencia-se das outras PCRs seguidas de restrição no produto de amplificação, por utilizar como alvo a região conservada dos minicírculos de kDNA das leishmânias... Em seguida, testamos a capacidade da PCR-RFLP mkDNA em diferenciar, também, as espécies L. (V.) guyanensis, L. (V.) shawi, L. (V.) naiffi, L. (V.) lainsoni e L. (L.) chagasi, todas presentes no Brasil. Para isto, fizemos um mapa de restrição nas seqüências de DNA da região conservada dos minicírculos de Leishmania depositadas no GenBank e testamos a PCR-RFLP mkDNA em cepas referência destas espécies e em 23 isolados de Leishmania de diferentes zimodemas, que confirmaram a identidade dos parasitos. Propomos um esquema de diferenciação que contempla a maioria das espécies de Leishmania presentes no Brasil, entretanto, não conseguimos diferenciar L. (V.) braziliensis de L. (V.) guyanensis. A partir destes resultados partimos para a aplicação da metodologia em dois conjuntos de amostras clínicas. No primeiro conjunto, testamos a PCR-RFLP mkDNA na identificação de Leishmania em amostras da região endêmica para LTA do Vale do Rio Doce - MG. Os parasitos foram extraídos de uma amostra de 475 lâminas coradas pelo Giemsa, arquivadas entre 1965-2000. A PCR-RFLP mkDNA foi positiva em 395 (83,2 por cento) laminas e L. (V.) braziliensis a única espécie presente na amostra. No segundo conjunto, avaliamos o uso da PCR-RFLP mkDNA na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA de diferentes áreas endêmicas do Brasil em amostras clínicas de 329 pacientes, de 6 estados do Brasil, preservadas de diversas formas. Independente da forma de preservação, a PCR-RFLP mkDNA detectou e identificou L. (V.) braziliensis (89,0 por cento), L. (L.) amazonensis (6,4 por cento) e L. (V.) lainsoni (4,6 por cento) nas amostras clínicas. Por ser uma técnica muito sensível, de rápida execução, de fácil leitura, confirmar as caracterizações dos parasitos feitas previamente por outros métodos, sugerimos a utilização da PCR-RFLP mkDNA como um método alternativo na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA no Brasil.