Defense against HSV-1 in a murine model is mediated by iNOS and orchestrated by the activation of TLR2 and TLR9 in trigeminal ganglia.

BACKGROUND: Herpes simplex 1 (HSV-1) causes various human clinical manifestations, ranging from simple cold sores to encephalitis. Innate immune cells recognize pathogens through Toll-like receptors (TLRs), thus initiating the immune response. Previously, we demonstrated that the immune response against HSV-1 is dependent on TLR2 and TLR9 expression and on IFN gamma production in the trigeminal ganglia (TG) of infected mice. In this work, we further investigated the cells, molecules, and mechanisms of HSV-1 infection control, especially those that are TLR-dependent. METHODS: C57BL/6 wild-type (WT), TLR2-/-, TLR9-/-, and TLR2/9-/- mice were intranasally infected with HSV-1. On the viral peak day, the TG and brains were collected from mice and TLR expression was measured in the TG and brain and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression was measured in the TG by real-time PCR. Immunofluorescence assays were performed in mice TG to detect iNOS production by F4/80+ cells. Intraperitoneal macrophages nitric oxide (NO) production was evaluated by the Griess assay. WT, CD8-/-, RAG-/-, and iNOS-/- mice were intranasally infected in a survival assay, and their cytokine expression was measured in the TG by real-time PCR. RESULTS: Infected WT mice exhibited significantly increased TLR expression, compared with their respective controls, in the TG but not in the brain. TLR-deficient mice had moderately increased TLR expression in the TG and brain in compare with the non-infected animals. iNOS expression in the WT infected mice TG was higher than in the other groups with increased production by macrophages in the WT infected mice, which did not occur in the TLR2/9-/- mice. Additionally, the intraperitoneal macrophages of the WT mice had a higher production of NO compared with those of the TLR-deficient mice. The CD8-/-, RAG-/-, and iNOS-/- mice had 100% mortality after the HSV-1 infection compared with 10% of the WT mice. Cytokines were overexpressed in the iNOS-/- infected mice, while the RAG-/- mice were nearly unresponsive to the virus. CONCLUSION: TLRs efficiently orchestrate the innate immune cells, eliciting macrophage response (with NO production by the macrophages), thereby controlling the HSV-1 infection through the immune response in the TG of mice.

Ativação da resposta imune inata mediada por receptores do tipo toll em infecção por vírus herpes simplex tipo 1(HSV-1) em modelo murino / Activation of the innate immune response mediated by toll receptors type in infection herpes simplex virus type 1 (HSV-1) in murine model

Este trabalho foi realizado no laboratório de Imunopatologia do Centro de Pesquisa RenéRachou (CPqRR) e no Laboratório de Vírus (Labvirus) da Universidade Federal de MinasGerais (UFMG). Os herpesvirus possuem genoma DNA e são envelopados.Aproximadamente 70% dos adultos já tiveram contato com Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1).O HSV-1 causa úlceras ou até mesmo lesões mais graves como encefalite, e após a infecção,o vírus comumente fica latente e pode ser ou não reativado. Células do sistema immuneinato, através dos “Receptores do Tipo Toll” (TLRs), reconhecem “padrões molecularesassociados a patógenos” (PAMPs) orquestrando a resposta imune contra o vírus. Quando ativados, TLRs iniciam uma cascata de sinalização que culmina na ativação de genesrelacionados à defesa imune inata (óxido nítrico-NO, citocinas e quimiocinas). Outros estudosdo grupo mostraram que animais nocautes (KO) para TLR9 ou TLR2/9 apresentam altamortalidade na infecção por HSV-1, ao contrário dos C57BL/6 selvagens (WT) e TLR2KO,que são capazes de controlar o vírus. Objetivamos pesquisar a interrelação na expressão dosTLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 em animais TLR2 KO, TLR9 KO e TLR2/9 KO infectados por HSV-1e principais citocinas, células e mecanismos imune celulares contra infecção por HSV-1. Nopresente trabalho camundongos WT, TLR2KO, TLR9KO e TLR2/9KO foram infectados viaintranasal com 106 u.f.p. de HSV-1, e seus controles receberam PBS. A eutanásia dos animaisfoi realizada no 5º dia após infecção (dpi), que previamente já foi demonstrado ser o pico dainfecção neste modelo, e então gânglios trigêmeos (TG) e cérebros foram coletados. Aexpressão de TLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 foi avaliada por PCR em Tempo Real. Camundongos WTinfectados apresentaram diferença significativa na expressão destes TLRs comparados comseus respectivos controles no TG, mas não no cérebro. Nos KOs, houve aumento da expressãodos TLRs tanto nos TGs (mas com níveis mais moderados comparado aos WT) quanto noscérebros. Também foi avaliada a expressão de gp91phox, p22phox e iNOS. A expressão de iNOSem C57BL/6 WT infectados foi maior que nos outros grupos, mas o mesmo não ocorreu paragp91phox, p22phox. Adicionalmente, foi mensurada a produção de NO por macrófagosintraperitoneais, através da reação de Griess, que demonstrou maior produção por macrófagosWT, comparados aos grupos TLR KOs. Ensaios de histopatologia e imunofluorescênciademonstraram maior celularidade nos TGs infectados, além de confirmar a presença de CD8,macrófagos, e aumento da produção de iNOS nos C57BL/6 WT infectados, o que não ocorreucom os camundongos TLRs KO. Em ensaio de sobrevivência com C57BL/6 WT, CCL3 KO,CD8 KO, RAG KO e iNOS KO a importância das células T e do iNOS foi confirmada, umavez que CD8 KO, RAG KO e iNOS KO tiveram 0% de sobrevida. Camundongos C57BL/6WT, RAG KO, CCL3 KO e iNOS KO tiveram seus TGs analisados por PCR em tempo realpara verificar a expressão do gene viral VP-16 e MCP-1, iNOS, IP-10, Rantes e TNF- no 5ºdpi. Estes dados indicaram a relevância de iNOS e das célúlas T na resposta inata contra oHSV-1, uma vez que os RAG KO foram irresponsivos à expressão das citocinas, enquanto osiNOS KO apresentaram uma resposta exacerbada das mesmas. Ensaio de citometria indicouque IFN produzido pelas células T CD8, nos TGs, e produzido pelas células T CD4 eNatural Killer (NK), nos linfonodos regionais, são um possível mecanismo de controle contraa infecção de HSV-1 dos animais WT infectados. Hipotetizamos que a expressão coordenadade TLRs reflete na orquestração eficiente do sistema imune inato, através da produçãoequilibrada de quimiocinas e citocinas e da atividade imune celular adequada, com produçãode NO por macrófagos e ação de células T CD8, T CD4 e NK controlando a infecção porHSV-1.

Ativação da Resposta Imune Inata Mediada por Receptores do Tipo Toll em Infecção por Vírus Herpes Simplex tipo 1(HSV-1) em Modelo Murino

Este trabalho foi realizado no laboratório de Imunopatologia do Centro de Pesquisa RenéRachou (CPqRR) e no Laboratório de Vírus (Labvirus) da Universidade Federal de MinasGerais (UFMG). Os herpesvirus possuem genoma DNA e são envelopados.Aproximadamente 70% dos adultos já tiveram contato com Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1).O HSV-1 causa úlceras ou até mesmo lesões mais graves como encefalite, e após a infecção,o vírus comumente fica latente e pode ser ou não reativado. Células do sistema immuneinato, através dos “Receptores do Tipo Toll” (TLRs), reconhecem “padrões molecularesassociados a patógenos” (PAMPs) orquestrando a resposta imune contra o vírus

Quandoativados, TLRs iniciam uma cascata de sinalização que culmina na ativação de genesrelacionados à defesa imune inata (óxido nítrico-NO, citocinas e quimiocinas). Outros estudosdo grupo mostraram que animais nocautes (KO) para TLR9 ou TLR2/9 apresentam altamortalidade na infecção por HSV-1, ao contrário dos C57BL/6 selvagens (WT) e TLR2KO,que são capazes de controlar o vírus. Objetivamos pesquisar a interrelação na expressão dosTLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 em animais TLR2 KO, TLR9 KO e TLR2/9 KO infectados por HSV-1e principais citocinas, células e mecanismos imune celulares contra infecção por HSV-1. Nopresente trabalho camundongos WT, TLR2KO, TLR9KO e TLR2/9KO foram infectados viaintranasal com 106 u.f.p. de HSV-1, e seus controles receberam PBS. A eutanásia dos animaisfoi realizada no 5º dia após infecção (dpi), que previamente já foi demonstrado ser o pico dainfecção neste modelo, e então gânglios trigêmeos (TG) e cérebros foram coletados. Aexpressão de TLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 foi avaliada por PCR em Tempo Real. Camundongos WTinfectados apresentaram diferença significativa na expressão destes TLRs comparados comseus respectivos controles no TG, mas não no cérebro. Nos KOs, houve aumento da expressãodos TLRs tanto nos TGs (mas com níveis mais moderados comparado aos WT) quanto noscérebros. Também foi avaliada a expressão de gp91phox, p22phox e iNOS. A expressão de iNOSem C57BL/6 WT infectados foi maior que nos outros grupos, mas o mesmo não ocorreu paragp91phox, p22phox. Adicionalmente, foi mensurada a produção de NO por macrófagosintraperitoneais, através da reação de Griess, que demonstrou maior produção por macrófagosWT, comparados aos grupos TLR KOs

Ensaios de histopatologia e imunofluorescênciademonstraram maior celularidade nos TGs infectados, além de confirmar a presença de CD8,macrófagos, e aumento da produção de iNOS nos C57BL/6 WT infectados, o que não ocorreucom os camundongos TLRs KO. Em ensaio de sobrevivência com C57BL/6 WT, CCL3 KO,CD8 KO, RAG KO e iNOS KO a importância das células T e do iNOS foi confirmada, umavez que CD8 KO, RAG KO e iNOS KO tiveram 0% de sobrevida. Camundongos C57BL/6WT, RAG KO, CCL3 KO e iNOS KO tiveram seus TGs analisados por PCR em tempo realpara verificar a expressão do gene viral VP-16 e MCP-1, iNOS, IP-10, Rantes e TNF- no 5ºdpi. Estes dados indicaram a relevância de iNOS e das célúlas T na resposta inata contra oHSV-1, uma vez que os RAG KO foram irresponsivos à expressão das citocinas, enquanto osiNOS KO apresentaram uma resposta exacerbada das mesmas. Ensaio de citometria indicouque IFN produzido pelas células T CD8, nos TGs, e produzido pelas células T CD4 eNatural Killer (NK), nos linfonodos regionais, são um possível mecanismo de controle contraa infecção de HSV-1 dos animais WT infectados. Hipotetizamos que a expressão coordenadade TLRs reflete na orquestração eficiente do sistema imune inato, através da produçãoequilibrada de quimiocinas e citocinas e da atividade imune celular adequada, com produçãode NO por macrófagos e ação de células T CD8, T CD4 e NK controlando a infecção porHSV-1

Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR9 expressed in trigeminal ganglia are critical to viral control during herpes simplex virus 1 infection.

Herpes simplex virus 1 (HSV-1) is a neurotropic DNA virus that is responsible for several clinical manifestations in humans, including encephalitis. HSV-1 triggers toll-like receptors (TLRs), which elicit cytokine production. Viral multiplication and cytokine expression in C57BL/6 wild-type (WT) mice infected with HSV-1 were evaluated. Virus was found in the trigeminal ganglia (TG), but not in the brains of animals without signs of encephalitis, between 2 and 6 days postinfection (d.p.i.). Cytokine expression in the TG peaked at 5 d.p.i. TLR9-/- and TLR2/9-/- mice were more susceptible to the virus, with 60% and 100% mortality, respectively, as opposed to 10% in the WT and TLR2-/- mice. Increased levels of both CXCL10/IP-10 and CCL2/MCP-1, as well as reduced levels of interferon-γ and interleukin 1-ß transcripts, measured in both the TG and brains at 5 d.p.i., and the presence of virus in the brain were correlated with total mortality in TLR2/9-/- mice. Cytokine alterations in TLR2/9-/- mice coincided with histopathological changes in their brains, which did not occur in WT and TLR2-/- mice and occurred only slightly in TLR9-/- mouse brain. Increased cellularity, macrophages, CD8 T cells producing interferon-γ, and expression levels of TLR2 and TLR9 were detected in the TG of WT-infected mice. We hypothesize that HSV-1 infection is controlled by TLR-dependent immune responses in the TG, which prevent HSV-1 encephalitis.