Papel dos corpúsculos lipídicos na proliferação e transformação celular / [Role of lipid bodies in cell proliferation and transformation]

RESUMO

Corpúsculos lipídicos são organelas dinâmicas envolvidas no metabolismo de lipídeos, no tráfego de membrana e na sinalização intracelular. A lipogênese está associada com um mau prognóstico em diversas doenças neoplásicas, sugerindo um papel dessas organelas no desenvolvimento do câncer. Foi mostrado anteriormente que corpúsculos lipídicos são elementos centrais na síntese de prostaglandina E2 e na proliferação celular em linhagens celulares de câncer de cólon, e podem estar implicados na patologia desta neoplasia. Baseado nesses dados, avaliamos a regulação dos corpúsculos lipídicos na progressão do ciclo celular e na transformação celular. Células NIH3T3 foram sincronizadas por confluência e privação de soro, e progressão pelo ciclo celular foi avaliada após suplementação com soro por incorporação de BrdU e por análise de qRT-PCR ou western blot de genes e proteínas do ciclo celular. Foi observado que, após suplementação, células NIH3T3 progridem para fase S em 24 horas, seguindo para as fases G2 e M após 36-48 horas. Além disso, análise de expressão de ciclinas confirmou que células sincronizadas progridem uniformemente pelo ciclo celular após suplementação com soro. Usando este modelo, avaliamos a regulação de corpúsculos lipídicos durante o ciclo celular. Quantificação e análise de localização subcelular mostraram que células em arresto na fase G1 apresentam menor quantidade e localização perinuclear de corpúsculos lipídicos, enquanto que um maior número e localização dispersa dessas organelas foram observados durante a fase S. Os mesmos resultados foram observados em células IEC-6. Além disso, estes dados foram confirmados em NIH3T3 através de microscopia de fluorescência com marcação simultânea de corpúsculos lipídicos e BrdU incorporado, ou através de sincronização específica na fase S por timidina. A linhagem transformada NIH3T3-H-rasV12 foi também submetida à confluência e privação de soro para análise de corpúsculos lipídicos, onde foi possível observar um aumento no número e localização dispersa de corpúsculos lipídicos, além do acúmulo da proteína estrutural ADRP, quando comparadas com a linhagem selvagem NIH3T3. Por outro lado, células NIH3T3 com superexpressão de ADRP humana não apresentaram características de transformação in vitro, como observado em ensaios de proliferação e morte celular, formação de focos, ou ensaio de crescimento independente de ancoragem. Juntos, esses resultados mostram que corpúsculos lipídicos são regulados durante a progressão do ciclo celular e que em células transformadas esta regulação está alterada, embora tenha sido visto que a superexpressão de ADRP não é capaz de induzir transformação celular em nosso modelo. Não obstante, esses dados dão evidências de que um mecanismo coordenado regula a progressão de ciclo celular e biogênese de corpúsculos lipídicos, que pode estar desregulado durante o desenvolvimento neoplásico. (AU)

ABSTRACT

Lipid bodies (or lipid droplets) are organelles involved in lipid turnover, membrane traffic and signaling. Lipogenesis has been associated with poor prognosis in several neoplasic diseases, suggesting a role for these organelles in cancer development. We have previously reported that lipid bodies are involved in prostaglandin E2 synthesis and cell proliferation in colon cancer cells, and may have implications to colon adenocarcinoma pathogenesis. Based on this, we evaluated the role of lipid bodies in cell cycle regulation and during cellular transformation. NIH3T3 cells were synchronized through confluence and serum starvation, and progression through cell cycle was assayed before or after 12, 24, 36 or 48 hours of serum supplementation by BrdU incorporation, and by qRT-PCR and western blot analysis of cell cycle genes and proteins. We observed that, upon serum supplementation, NIH3T3 cells reached S phase after 24 hours and G2/M phase after 36-48 hours, confirming that synchronized NIH3T3 progressed uniformly through cell cycle after stimulus. Using the same model, we evaluated the regulation of lipid bodies during cell cycle progression by fluorescence microscopy and flux citometry. We observed that cells arrested on G1 phase showed a lower number and perinuclear localization of lipid bodies, whereas an increased number of lipid bodies with a dispersed distribution through the cytoplasm were observed during S phase. The same results were seen in IEC-6 cells. These data were also confirmed in NIH3T3 cells by microscopy analysis after simultaneous staining of lipid bodies and incorporated BrdU, and with thymidine synchronization to assess regulation of lipid bodies in S cell cycle phase. The transformed cell lineage NIH3T3-H-rasV12 was also submitted to confluence and serum starvation for lipid bodies' analysis, showing increased number and dispersed localization of lipid bodies, along with increased ADRP protein accumulation, when compared with NIH3T3 cells. In the other hand, NIH3T3 cells overexpressing human ADRP did not display transformed phenotype in vitro, as observed in cell death and proliferation, foci formation, and anchorage-independent growth assays. Taken together, these results suggest that lipid bodies are highly regulated during cell cycle, and that this regulation is altered in transformed cells, although ADRP overexpression was not able to induce cell transformation in our model. Nevertheless, these data provide evidence for a coordinate mechanism that regulates cell cycle progression and lipid body biogenesis, which might be deregulated during cancer development. (AU)