Efeito da terapia fotodinâmica antimicrobiana sobre culturas planctônicas e biofilmes de bactérias e fungos utilizando curcumina e cloro-alumínio ftalocianina veiculada por nanoemulsões / Effect of antimicrobial photodynamic therapy against planktonic and biofilm cultures of bacteria and fungi mediated by curcumin and aluminum-chloride- phthalocyanine entrapped in nanoemulsions

RESUMO

Esta investigação teve os seguintes objetivos: 1. avaliar in vitro o efeito da Terapia Fotodinâmica (PDT) utilizando diferentes concentrações de curcumina e doses de luz LED na inativação de suspensões planctônicas de S. aureus resistente (MRSA) e susceptível à meticilina (MSSA) e a citotoxicidade dos parâmetros antimicrobianos dessa terapia em cultura celular de fibroblastos; 2. o efeito fotodinâmico da cloro-alumínio ftalocianina (ClAlFt) veiculada em nano-emulsão catiônica e aniônica e comparar com ClAlFt diluída em solvente orgânico na inativação da C. albicans quando em suspensão planctônica e organizados em biofilmes; 3. o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica utilizando a cloroalumínio ftalocianina em sistema de nanoemulsão em culturas planctônicas e biofilmes de bactérias gram-positivas (MSSA e MRSA). No primeiro estudo, suspensões de MSSA e MRSA foram tratadas com diferentes concentrações de curcumina (entre 0,1 a 20,0 µM) e expostas a diferentes fluências de LED azul (18; 25 e 37,5 J/cm2 ). Em seguida, diluições seriadas foram obtidas e alíquotas de 25 µl de cada diluição foram plaqueadas em meio de cultura Mannitol Salt Agar. Após o período de incubação de 48 horas a 37°C, as unidades formadoras de colônias foram determinadas (UFC/mL). Para as células L929, essas foram incubadas por 20 minutos com curcumina e irradiadas em seguida com LED (37,5 J/cm2 ). A viabilidade celular após a PDT foi avaliada utilizando o teste de MTT e as alterações morfológicas foram avaliadas pela microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados foram submetidos à análise descritiva, Análise de Variância (ANOVA) e post hoc de Tukey (α= 5%). As concentrações de 5, 10 e 20 µM resultaram em completa inativação do MSSA quando associadas a qualquer fluência de energia avaliada. Entretanto, somente a concentração de 20 µM associadas a dose de luz de 37,5 J/cm2 resultou em completa inativação do MRSA. Essa associação resultou em 80% de redução dos fibroblastos. Além disso, alterações na morfologia celular foram observadas, indicando que a membrana citoplasmática foi o principal alvo dessa terapia. Os controles de luz e curcumina não causaram alterações significativas tanto na contagem de colônias quanto nos valores do metabolismo celular. No segundo estudo, suspensões de C. albicans foram tratadas com a cloro-alumúnio ftalocianina (ClAlFt) na concentração de 31,8 µM encapsulada em nanoemulsões (NE) de caráter catiônico e aniônico e a ClAlFt livre por 30 minutos no escuro. Em seguida, as amostras foram centrifugadas para remoção do fármaco e 300 µl de solução salina foi adicionado previamente à irradiação com LED (660 ± 3 nm; 50 e 100 J/cm2 ). Amostras controle negativo não foram expostas a ClAlFt nem luz. Para as soluções planctônicas, as colônias foram determinadas (UFC/mL) após 48 horas de incubação. Além disso, o metabolismo celular foi avaliado por meio do teste de XTT e a técnica de citometria de fluxo foi utilizada para avaliar danos a membrana celular. Para os biofilmes, a atividade metabólica foi avaliada pelo XTT e a distribuição da ClAlFt utilizando os diferentes veículos no interior dos biofilmes foi analisada por microscopia confocal. Os dados de CFU/mL e os valores de absorbância obtidos pelo teste de XTT foram analisados pelo Kruskal-Wallis e teste de comparações múltiplas dos postos médios. Já para a citometria de fluxo foi utilizado ANOVA um critério (α= 0,05%). A viabilidade fúngica foi dependente do veículo, da carga superficial e dose de luz. A ClAlFt livre inativou completamente o fungo quando associada a maior dose de luz. Já a NE catiônica causou redução significativa tanto de CFU/mL (~ 3,1 log) quanto do metabolismo celular em cerca de 92,3% quando comparada ao controle (p<0,05). Além disso, ambas as veiculações resultaram em danos a membrana citoplasmática significativos (p<0,05). Para os biofilmes, a NE catiônica resultou em redução de 70% do metabolismo. A FS aniônica não apresentou atividade antifúngica. As imagens obtidas pela microscopia confocal demonstraram diferentes padrões de acúmulo e intensidade de fluorescência no interior dos biofilmes para os diferentes sistemas de veiculação de fármacos avaliados. No estudo 3, suspensões e biofilmes de MSSA e MRSA foram tratados com a ClAlFt livre e com os sistemas de NE catiônico e aniônico contendo esse fármaco. Após o período de pré-incubação, o fármaco foi removido e a irradiação foi realizada por um sistema de LED (660 ± 3 nm). Para as suspensões planctônicas bacterianas, foi avaliado o número de unidade formadoras de colônias (UFC/mL) e o metabolismo celular pelo teste de XTT. Já para os biofilmes, foi avaliado o metabolismo pelo XTT. Assim como para o fungo, a eficiência da PDT foi dependente do veículo, carga superficial e dose de luz. A NE catiônica e a ClAlFt livre causaram completa inativação de ambas as cepas de S. aureus. Para os biofilmes, a NE catiônica reduziu em cerca de 80 e 73% o metabolismo celular da cepa susceptível e da resistente, respectivamente. A NE aniônica, apesar de reduzir em cerca de 4 log e 1 log o número de UFC/mL para o MSSA e MRSA, respectivamente, não causou redução do metabolismo dos biofilmes do MRSA mesmo quando associada a maior dose de luz avaliada. Esses resultados sugerem que a NE catiônica representa uma veiculação viável para inativação de fungos e bactérias, incluindo cepas resistentes aos tratamentos convencionais

ABSTRACT

The aim of this investigation was to evaluate 1. the Photodynamic Therapy (PDT) mediated by curcumin for in vitro inactivation of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) and susceptible S. aureus (MSSA) and its citotoxic effects against L929 fibroblasts; 2. the photodynamic potential of aluminum-chloride-phthalocyanine (ClAlPc) entrapped in cationic and anionic nanoemulsions (NE) to inactivate C. albicans planktonic and biofilm cultures compared with free ClAlPc; 3. the photodynamic effect of ClAlPc encapsulated in NE on methicillin susceptible and resistant S. aureus suspensions and biofilms. In the first study, suspensions of MSSA and MRSA were treated with different concentrations of curcumin and exposed to LED. Serial dilutions were obtained from each sample, and colony counts were quantified. For fibroblasts, the cell viability subsequent to the curcumin-mediated photodynamic therapy was evaluated using the MTT assay and morphological changes were assessed by SEM analysis. Curcumin concentrations ranging from 5.0 to 20.0 µM in combination with any tested LED fluences resulted in photokilling of MSSA. However, only the 20.0 µM concentration in combination with highest fluence resulted in photokilling of MRSA. This combination also promoted an 80% reduction in fibroblast cell metabolism and morphological changes were present, indicating that cell membrane was the main target of this phototherapy. In the second study, fungal suspensions were treated with different types of delivery systems containing ClAlPc. After 30 minutes, the drug was washed-out and samples were illuminated with LED source (660 ± 3 nm). Negative control samples were not exposed to ClAlPc or light. For planktonic suspensions, colonies were counted (CFU/ml) and cell metabolism was evaluated by XTT assay. (Kruskal-Wallis and Multiple Comparison test; α= 0.05%). Flow cytometry was used to evaluate damage to cell membrane. (One-way ANOVA; α= 0.05%). For biofilms, the metabolic activity was evaluated by means of XTT reduction assay and ClAlPc distribution using the different delivery systems through three-dimensional architecture of the biofilms were analyzed by confocal laser scanning microscopy (CLSM). Fungal viability was dependent on the delivery system, superficial charge and light dose. Free ClAlPc caused photokilling of the yeast when combined with a higher light dose. Cationic NE-ClAlPc reduced significantly both CFU/mL (~3.1 log10) and cell metabolism (92.3%) compared with the negative control (p<0.05). In addition, cationic NE-ClAlPc and free-ClAlPc caused significant damage to the cell membrane (p<0.05). For the biofilms, cationic NE-ClAlPc reduced cell metabolism by 70%. Anionic NE-ClAlPc did not present antifungal activity. CLSM showed different accumulation and fluorescence intensities emissions on biofilm structure for the evaluated delivery systems. In the third study, suspensions and biofilms of MRSA and MSSA were treated with different delivery systems containing ClAlPc. After the preincubation period, the drug was washed-out and irradiation was performed with LED source (660 ± 3 nm). Negative control samples were not exposed to ClAlPc or light. For the suspensions, colonies were counted (CFU/mL). The metabolism of S. aureus suspensions and biofilms were evaluated by the XTT assay. The efficiency was dependent on the delivery system, superficial load and light dose. Cationic NEClAlPc and free-ClAlPc caused photokilling of the both strains of S.aureus. For biofilms, cationic NE-ClAlPc reduced cell metabolism by 80 and 73% of susceptible and resistant strains, respectively. Although anionic NE-ClAlPc caused a significant CFU/mL reduction for MSSA and MRSA, it was not capable of reducing MRSA biofilm metabolism. ClAlPc entrapped in cationic NE or in its free form combined with LED caused photokilling of both S. aureus strains evaluated and reduction of the metabolic activity of biofilms. This therapy may represent an alternative treatment for eradicating resistant strains