Efeito citotóxico e antimicrobiano de análogos de peptídeos catiônicos e sua influencia na expressão de marcadores fenotípicos e genotípicos de mineralização dentinária / Cytotoxic and antimicrobial effects of analogues of cationic peptides and their influence in the expression of phenotypic and genotypic markers of dentin mineralization

RESUMO

Os objetivos do estudo foram avaliar os efeitos citotóxico e antimicrobiano de análogos de peptídeos catiônicos e sua influência na expressão de marcadores fenotípicos e genotípicos de mineralização dentinária. Fibroblastos da linhagem L929 foram expostas a diluições seriadas dos peptídeos LL-37 e análogos hBD-3-1CV e KR-12-a5 e a viabilidade das células foi avaliada por ensaios de metil tiazol tetrazólio (MTT). Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração letal mínima (CLM) para os peptídeos e controles (clorexidina – CHX) foram determinadas contra Streptococcus mutans, Actinomyces israelii, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis, pelo método de microdiluição, após 4 e 24 horas. Biofilmes de E. faecalis e F. nucleatum foram formados sobre blocos de dentina radicular bovina e expostos a 5X e 10X MLC do peptídeo com melhor atividade antimicrobiana e CHX e analisadas por contagem de unidades formadoras de colônias/ml (UFC/ml) e por Microscopia de Varredura Confocal à Laser (CLSM). Células semelhantes à odontoblastos da linhagem MDPC-23 foram expostas a diluições seriadas de LL-37, hBD-3-1CV, KR-12- A5 por 24 horas, seguidas de trocas de meio osteogênico por 7 dias e avaliada a viabilidade celular, produção de proteína total (TP), atividade da fosfatase alcalina (ALP) e deposição de nódulos mineralizados. A expressão de genes de marcadores de mineralização (sialofosfoproteína dentinária - DSPP e fosfoproteína de matriz dentinária - DMP-1) foi realizada por PCR quantitativo, após 24 h de exposição aos peptídeos e de incubação durante 14 dias em meio osteogênico. LL-37/hBD-3-1CV e KR-12-a5 afetaram o metabolismo dos fibroblastos em concentrações acima de 500 e 250 µg/ml, respectivamente. KR-12-a5 teve os melhores valores de CIM/CLM contra todos os microrganismos e ambos os tempos de exposição. Os crescimentos de E. faecalis e C. albicans foram afetados apenas por KR-12-a5 e CHX. hBD-3-1CV e LL-37 tiveram...

ABSTRACT

The objectives of the study were to evaluate the cytotoxic and antimicrobial effects of analogues of cationic peptides and their influence in the expression of phenotypic and genotypic markers of dentin mineralization. L929 fibroblast cells were exposed to serial dilutions of peptides LL-37, hBD-3-1CV and KR-12-a5 and cell metabolism was evaluated by methyl thiazol tetrazolium (MTT) assays. Minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal lethal concentration (MLC) of peptides and controls (chlorhexidine – CHX) were determined for Streptococcus mutans, Actinomyces israelii, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Fusobacterium nucleatum and Porphyromonas gingivalis, by microdilution method, after 4 and 24h. E. faecalis and F. nucleatum biofilms were formed in blocks of bovine root dentin and exposed to 5X and 10X MLC of the peptide with the best antimicrobial activity and CHX and analyzed by colonies forming units/ml (CFU/ml) counts and by Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM). MDPC-23 odontoblast-like cells were exposed to serial dilutions of peptides LL-37, hBD-3-1CV and KR-12-a5 for 24 hours, followed by changes of osteogenic medium for 7 days and evaluated cell viability, total protein (TP) production, alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralized nodule deposition. The gene expression of mineralization markers (Dentin Sialophosphoprotein - DSPP and Dentin matrix phosphoprotein 1 - DMP-1) was performed by quantitative PCR, after 24h of peptide exposure and incubation for 14 days in osteogenic medium. LL-37 and hBD-3-1CV affected cell metabolism at concentrations above 500µg/ml and KR-12-a5 above 250µg/ml. KR-12-a5 had the best MIC/MLC values against all microorganisms and both times of exposure. E. faecalis and C. albicans growth was affected only for KR-12-a5 and CHX. hBD-3-1CV and LL-37 had similar inhibitory effect against S. mutans and A. israelii. KR-12-a5 reduced E. faecalis growth in biofilm assays, with similar results to...