Modulação da proliferação, apoptose e autofagia de linfocitos T por RAGE / Modulation of proliferation, apoptosis and autophagy of T lymphocytes by RAGE

RESUMO

RAGE (Receptor for advanced glycation endproducts) é um receptor de padrões moleculares (PRR) reconhecido principalmente por seu envolvimento na patogênese de complicações secundárias do Diabetes Mellitus. Sua ativação está relacionada à modulação da resposta imune-inflamatória, promovendo ativação, migração e maturação de leucócitos; e induzindo a liberação de citocinas inflamatórias. A sinalização via RAGE também está relacionada à regulação dos processos de sobrevivência, apoptose e autofagia celular. Pouco se sabe sobre o papel de RAGE na regulação desses processos em células da resposta imune adaptativa e, especificamente, em linfócitos T. Nosso objetivo foi avaliar a influência da ativação de RAGE na biologia de células T. Para isso, observamos seus efeitos na modulação da proliferação, apoptose e autofagia, e a contribuição da ativação de NF-κB na indução desses processos. Células de linhagem de linfócitos T (JM/Jurkat) foram estimuladas com os ligantes de RAGE BSA-AGE (100 e 200 µg/mL) e S100b (10 µg/mL). A estimulação também foi realizada mediante a pré-ativação do receptor de células T (TCR). Experimentos de ganho de função foram realizados por meio da transfecção transitória das células com um vetor plasmidial de RAGE. A proliferação celular foi determinada por ensaio de exclusão com azul de Trypan. A apoptose foi avaliada através da detecção da fragmentação do DNA pelo método TUNEL e da expressão de p53, Bax e Bcl-2 por Western blot. Ainda por Western blot, observamos a expressão de proteínas características do processo de autofagia, p62 e LC3; e de p50, subunidade do fator de transcrição NF-κB. O estímulo com BSAAGE e S100b não alterou a proliferação e a viabilidade, mas, em células transfectadas, esse estímulo tendeu a aumentar a proliferação e a viabilidade, sobretudo após a pré-ativação das células. O BSA-AGE e o S100b produziram efeitos distintos sobre a apoptose a depender da pré-ativação e do período experimental avaliado. O estímulo com os agonistas de RAGE atenuaram a inibição de LC3 e p53 induzida pela camptotecina. Efeito de "resgate" semelhante foi verificado na expressão de p50. O estímulo de RAGE parece favorecer a proliferação e a autofagia de linfócitos T. Os seus efeitos sobre a apoptose variam de acordo com o tipo, concentração e período de exposição ao ligante utilizado

ABSTRACT

RAGE (Receptor for advanced glycation endproducts) is a pattern recognition receptor (PRR) that is especially recognized for its involvement in the pathogenesis of secondary complications of Diabetes Mellitus. Its activation is related to the modulation of immune-inflammatory responses, by promoting activation, maturation and migration of leukocytes, as well as the induction of inflammatory cytokines. RAGE signaling is also related to the regulation of cellular processes like survival, apoptosis and autophagy. Little is known about the role of RAGE in the regulation of these processes in cells of the adaptive immune response, specifically in T lymphocytes. Our main purpose was to evaluate the influence of RAGE activation in T cell biology. We observed the role of this receptor in the modulation of proliferation, apoptosis and autophagy, and the contribution of NF-kB in the induction of these processes. A human cell line of T lymphocytes (JM/ Jurkat) were stimulated with the RAGE ligands BSA-AGE (100 and 200 µg/mL) and S100B (10 µg/mL). The stimulation was also performed after pre-activation of the T cell receptor (TCR). Gain of function experiments were performed by transient transfection of cells with a plasmid vector to increase RAGE expression. Cell proliferation was determined by Trypan blue dye exclusion assay. Apoptosis was assessed by the detection of DNA fragmentation by the TUNEL method, and p53, Bax and Bcl-2 expression by Western blotting. Also by Western blotting, we observed the effect of RAGE on the expression of autophagy-related proteins, p62 and LC3, and on the expression of p50, subunit of the transcription factor, NF-κB. The stimulation with BSA- AGE and S100b did not alter the proliferation and viability, but, in transfected cells, this stimulation tended to increase proliferation and viability, especially after the cell pre-activation. BSA-AGE and S100b had distinct effects on apoptosis depending on the cell pre-activation and trial period evaluated. The stimulation with agonists of RAGE attenuated the inhibition of LC3 and p53 induced by camptothecin. Similar effect was observed in the expression of p50. The stimulation of RAGE seems to favor the proliferation and autophagy of T lymphocytes. Its effects on apoptosis may vary according to the type, concentration and period of exposure to the ligand used