Efeito antimicrobiano e modulador da resposta imune dos peptídeos hBD-3 e LL-37 e dos polifenóis do chá verde e do cranberry / Antimicrobial and immune regulatory activity of the peptides hBD-3, LL-37 and the polyphenols from cranberry and green tea

RESUMO

Os peptídeos antimicrobianos como por exemplo a catelicina (LL-37) e as defensinas humanas (hBD-1, hBD-2 e a hBD-3) são considerados antibióticos endógenos com importante papel na prevenção das doenças periodontais, devido a sua capacidade de regulação da resposta imune, sendo que os mesmos podem ser degradados pelos periodontopatógenos. Terapias que aumentem a produção destes peptídeos pelas próprias células do organismo, assim como a associação destes peptídeos com compostos naturais os quais possam agir em sinergismo na regulação da resposta imune, podem ser considerados novas estratégias para o melhor controle das doenças periodontais. Portanto os objetivos deste estudo in vitro foram: i) Avaliar a capacidade do extrato do chá verde (Camellia sinensis) e do seu polifenol, o EGCG, sobre a expressão gênica de hBD-1 e hBD-2 pelas células epiteliais gengivais (B11), sobre a degradação das mesmas frente ao P. gingivalis, ii) Através da utilização do modelo 3D de co-cultura celular, avaliar a capacidade antiinflamatória dos peptídeos hBD-3 e LL-37 quando em associação sobre a produção de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento, iii) Avaliar a capacidade anti-inflamatória da associação do EGCG e do polifenol proveniente do cranberry, o AC-PACs, com o peptídeo LL-37 sobre a produção de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento em modelo de co-cultura celular. As células epiteliais gengivais (B11) foram estimuladas com o extrato do chá verde e com o EGCG na presença e ausência de inibidores específicos. A produção e expressão gênica de hBD-1 e hBD-2 foram quantificados respectivamente pelas técnica de ELISA e qPCR. A capacidade do extrato do chá verde e do EGCG em proteger a degradação de hBDs pelo P. gingivalis foi mensurado através da técnica de ELISA. Foi desenvolvido um modelo em 3D de co-cultura de fibroblastos gengivais embebidos em uma matriz de colágeno com células epiteliais gengivais semeadas em sua superfície, no qual observou-se efeito sinérgico das células na secreção de IL-6 e IL-8 em resposta ao estímulo com LPS de A. actinomycetemcomitans (1 µg/ml) quando comparados as células individuais. Em seguida o modelo em 3D de co-cultura celular na presença no LPS de A. actinomycetemcomitans foi estimulado com: i) hBD-3 (10 and 20 µM) e LL-37 (0.1 and 0.2 µM), ii) EGCG (1 e 5 µg/ml) e LL-37 (0.1 and 0.2 µM) e iii) AC-PACs (25 e 50 µg/ml) e LL-37 (0.1 and 0.2 µM), individualmente e em associação. Foi utilizada a técnica de ELISA Multiplex para quantificar 41 diferentes citocinas, quimiocinas, fatores de crescimentos e 13 diferentes MMPs e TIMPs. Os resultados demonstraram que: i) o extrato do chá verde e o EGCG aumentaram a produção e a expressão gênica de hBD-1 e hBD-2 pelas células epiteliais de uma maneira dose-dependente, e foram capazes de prevenir a degradação das hBD-1 e hBD-2 recombinantes pelo sobrenadante de P. gingivalis, ii) o peptídeo hBD-3 em associação com o LL37 mostrou efeito sinérgico na diminuição da produção de GRO-α, G-CSF, IP-10, IL-6, e MCP1, entretanto teve apenas efeito aditivo na redução da produção de IL-8 em resposta ao estímulo com LPS de A. actinomycetemcomitans, iii) a associação do peptídeo LL-37 com o EGCG e com o AC-PACs mostraram efeito sinérgico na redução da produção de GRO-α, G-CSF e IL-6 em resposta ao estímulo com LPS de A. actinomycetemcomitans. Portanto os peptídeos antimicrobianos hBD-3 e LL-37, assim como o extrato do chá verde, o EGCG e o AC-PACs por demonstrarem capacidade de regular a produção de citocinas inflamatórias, induzir a produção de defensinas pelas próprias células e proteger as defensinas da degradação pelo P. gingivalis surgem como promissores alternativas para terapias adjuntas ao tratamento periodontal convencional. Entretanto estudos clínicos futuros são necessários para avaliar o papel dos peptídeos e dos compostos naturais na cavidade oral e na proteção dos tecidos periodontais frente à uma agressão

ABSTRACT

The antimicrobial peptides LL-37, hBD-1, hBD-2 and hBD-3 are considered an endogenous antibiotic, with important role in the prevention of periodontal diseases due to their ability to regulate the immune response. However those peptides could be degraded by periodontal pathogens. Therefore, therapies able to up regulate the secretion of those peptides by human cells, and the association of antimicrobial peptides with natural compounds, which may act in synergism to modulate the immune response, may be a novel approach for effectively controlling periodontal diseases. The aim of this in vitro study were: i) investigate the ability of green tea extract and EGCG to induce hBD-1 and hBD-2 secretion and gene expression by gingival epithelial cells (B11) and to protect hBDs from degradation by P. gingivalis, ii) A 3D co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts stimulated with A. actinomycetemcomitans LPS (1 µg/ml) were used to investigated the anti-inflammatory properties of the hBD-3, LL-37, ACPACs and EGCG and to determine whether LL-37 acts in synergy with AC-PACs, EGCG and hBD-3. Gingival epithelial cells were stimulated with green tea extract or EGCG in the presence and absence of specific inhibitors. The secretion and gene expression of hBD-1 and hBD-2 was respectively measured by ELISA and qPCR. The ability of green tea extract and EGCG to prevent hBDs degradation by P. gingivalis present in a bacterial culture supernatant was evaluated by ELISA. A 3D co-culture model composed of gingival fibroblasts embedded in a collagen matrix overlaid with gingival epithelial cells had a synergistic effect with respect to the secretion of IL-6 and IL-8 in response to A. actinomycetemcomitans LPS stimulation compared to fibroblasts and epithelial cells individually. The 3D co-culture model was stimulated with noncytotoxic concentrations of: i) hBD-3 (10 and 20 µM) and LL -37 (0.1 and 0.2 µM), ii ) EGCG (1 and 5 µg/ml) and LL -37 (0.1 and 0.2 µM), iii) AC- PACs (25 and 50 µg/ml) and LL-37 (0.1 and 0.2 µM) alone and in association in the presence of A. actinomycetemcomitans LPS. A multiplex ELISA assay was used to quantify the secretion of 41 different cytokines, chemokines, growth factors and 13 different MMPs and TIMPs. Ours results showed that: i) the secretion and gene expression of hBD-1 and hBD-2 was up-regulated in a dose-dependent manner by green tea extract and EGCG. Green tea extract and EGCG were also able to prevent the degradation of recombinant hBD-1 and hBD-2 by a culture supernatant of P. gingivalis, ii) hBD-3 in association with LL-37 showed a synergistic effect to reduce the secretion of GRO- α, G-CSF, IP- 10, IL -6 and MCP -1, however had only additive effect on reducing the secretion of IL-8 in response to A. actinomycetemcomitans LPS stimulation, iii) the association of the peptide LL- 37 with EGCG and with AC- PACs showed a synergistic effect to reduce the secretion of GRO-α, G-CSF and IL-6 in response to A. actinomycetemcomitans LPS stimulation. Considering that the antimicrobial peptides hBD-3 and LL-37, as well as green tea extract, EGCG and AC- PACs, demonstrated the ability to regulate the secretion of inflammatory cytokines, up regulated the secretion of defensins by the cells and even to protect the defensins degradation by P. gingivalis, emerged as promising alternative adjunct therapy to conventional periodontal treatment. However future clinical studies are necessary to evaluate the role of peptides and natural compounds in the oral cavity and periodontal tissues